基于DNA杂交链反应放大策略的DNA甲基化转移酶活性及羟甲基化程度电化学分析

摘要

DNA甲基化是目前研究最多的DNA表观遗传修饰之一。DNA甲基化由DNA甲基转化移酶催化完成的。由于DNA甲基化状态是可被逆转的，也就是存在DNA去甲基化过程，但相对于甲基化过程，去甲基化过程更加复杂。DNA的甲基化与去甲基化这两个过程相互平衡，维持了DNA甲基化模式的稳定。大量研究表明，许多重要的过程如胚胎发育和细胞周期调控都与甲基化息息相关，而多个癌症也表现出异常的甲基化模式。因此，发展简易、灵敏、准确、可靠的用于定位、定量分析DNA甲基化的方法是至关重要的。相对于其他方法，电化学拥有如检测时间短、操作简单、费用低、易于小型化等诸多优势，是一种具有良好发展前景的分析测试方法。本论文旨在建立某些疾病DNA的电化学、去甲基化程度的电化学检测方法，为某些疾病的临床诊断和治疗观察提供准确、快速和灵敏的方法。本论文的主要工作是通过DNA杂交链反应，实现DNA甲基化、去甲基化状态及DNA甲基化转移酶的电化学信号放大检测。
　　1.DNA甲基化转移酶（MTase）活性与肿瘤发生，发展密切相关。本文建立了免标记超结构电化学方法用于信号放大检测DNA甲基转移酶活性（例如使用M.SssI甲基化转移酶）。控制固定在金电极上低密度的DNA有利于形成DNA超结构，从而有效地实现信号放大。以RuHex作为电化学信号分子，可以静电吸附到双链DNA上，实现了免标记的电化学检测。实验证明，使用差分脉冲伏安法(DPV)能够有效的检测DNA甲基化转移酶的活性，线性范围为0.5-120U/mL，信噪比为3时，检出限为0.025U/mL。此外，在细胞裂解液内依然可以检测甲基化转移酶的活性。同时，本文也证实了该方法应用于快速估测和筛选甲基化转移酶抑制剂，它可以有助于探索与甲基化相关的抗癌药物。
　　2.DNA去甲基化过程是DNA甲基化的可逆过程，研究发现，5-甲基胞嘧啶(5mC)在TET酶的催化氧化作用下生成5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)，5hmC的发现为DNA去甲基化研究提供了新的思路。且5hmC在体细胞重编程，胚胎发育和启动哺乳动物DNA去甲基化中有重要作用。因此检测DNA样品中5hmC的含量是十分必要的。在本文中，我们建立了基于DNA杂交链反应(HCR)信号扩增电化学方法用来有效的量化DNA羟甲基化程度。当DNA序列中羟基化的胞嘧啶在UDP-glucose存在下被T4-βGT作用形成5ghmC，并阻碍MspJI识别剪切，经辅助DNA(FcA-S3&S4)杂交作用后，与吸附到DNA链上的RuHex形成电子转移通道，使信号放大。(I2-I0/I1-I0)代表双链DNA羟基化比例，实验证明，当羟甲基化DNA的比例在1％到90％范围内，(I2-I0/I1-I0)呈线性关系，线性相关系数是0.9967，信噪比为3时，估算最低检测限是0.05％。该方法因其灵敏度高和响应速度快。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 DNA甲基化分析方法

1．2 DNA甲基化的电化学分析

1．2．1 DNA甲基化的直接电化学分析

1．2．2 DNA甲基化的间接电化学分析

1．2．3 电致化学发光分析方法

1．2．4 光致发电分析方法

1．3 DNA甲基化与DNA去甲基化

1．4 论文的指导思想

第二章 基于免标记、超结构信号扩增的DNA甲基化转移酶活性电化学分析

2．1 引言

2．2 实验部分

2．2．1 试剂

2．2．2 仪器

2．2．3 金电极处理

2．2．4 双链DNA(ds-DNA)制备

2．2．5 探针DNA的固定

2．2．6 CpG的甲基化和抑制

2．2．7 限制性内切酶BstUI的剪切

2．2．8 DNA超结构串联杂交

2．2．9 细胞培养

2．3 结果与讨论

2．3．1 基于DNA杂交链反应甲基化转移酶活性的检测原理

2．3．2 实验方法的可行性分析

2．3．3 生物传感器的阻抗表征

2．3．4 MCH修饰时间的选择

2．3．5 甲基化时间的选择

2．3．6 DNA甲基化转移酶的电化学活性分析

2．3．7 探究甲基化转移酶活性抑制剂的影响

2．3．8 在A549细胞裂解液环境中甲基化转移酶的活性检测

2．4 结论

第三章 基于DNA杂交链反应电化学定量检测DNA羟甲基化含量

3．1 前言

3．2 实验部分

3．2．1 试剂

3．2．2 仪器

3．2．3 金电极处理

3．2．4 双链DNA(ds-DNA)制备

3．2．5 探针DNA的固定

3．2．6 重组T4-βGT

3．2．7 限制性内切酶MspJI的剪切

3．2．8 DNA超结构串联杂交

3．3 结果与讨论

3．3．1 实验方法的可行性分析

3．3．2 氧化还原标记核酸的电化学

3．3．3 氧化还原标记核酸的电化学阻抗

3．3．4 MspJI剪切甲基化双链DNA时间的影响

3．3．5 T4-βGT重组羟甲基化双链DNA时间的影响

3．3．6 电化学分析定量测定核酸序列中的羟甲基化DNA含量

3．4 结论

第四章 总结

参考文献

在读期间发表的学术论文及研究成果

致谢