土壤产电信号及产电微生物与土壤污染的关系研究

摘要

土壤中存在大量有机质以及许多具有产电能力的微生物，可以用于微生物燃料电池(MFCs)的构建并产电。但是，土壤产电能力与土壤性质及相关细菌群落的关系仍未被阐明。产电信号由产电微生物作用产生，从土壤中分离培养产电菌将为土壤产电提供最直接的证据。土壤产电信号与土壤污染的关系也极有可能反映土壤污染状况以及土壤微生物的活性。
　　本研究在全国范围内选取了7种在pH和有机碳含量等性质上有差异的土壤类型，研究了土壤产电能力与土壤性质及相关细菌群落的关系。产电信号指标通过土壤MFCs的构建和运行获得，并对MFCs运行前后土样的理化与微生物性质进行测定。同时，富集土样中的Fe(Ⅲ)还原菌，采用高通量焦磷酸测序手段对富集物的微生物群落进行分析。实验结果显示:不同类型土壤的产电特征存在差异，有机碳含量较高土样的产电信号指标产电量和电压峰值显著高于含量较低的土样。土样的Fe(Ⅲ)还原菌群落结构对应其产电能力也存在差别。冗余分析结果显示，土壤有机碳、可溶性有机碳含量与产电信号指标呈正相关关系。我们推测土壤有机碳含量可能是土壤产电的重要驱动因子。
　　本研究也对7个土壤类型样品中的产电细菌进行了分离鉴定。在厌氧条件下，通过对Fe(Ⅲ)还原菌的富集和分离，共获得15类Fe(Ⅲ)还原菌菌株。菌株的系统分类和产电能力鉴定结果显示:全部15类菌株都具有产电能力，其中的11类菌株属于Clostridium，它们催化的MFCs的最大功率密度为16.4-28.6 mWm-2。从每个土样中均获得分离的主要菌株经鉴定被命名为Clostridium sporogenesSE6。对其催化的MFCs的产电性能和电化学体系分析结果显示:最大功率密度为44 mW cm-2;阳极阻抗为1488Ω cm-2;阳极体系的电化学活性物质是与电极直接接触的。结合MFCs阳极样品的扫描电镜照片，我们推测SE6的胞外电子传递机制可能是依靠膜结合细胞色素进行的直接电子传递。
　　本研究选取Cu、Cd及芘分别作为重金属与有机污染物的模式污染物，研究土壤产电信号与土壤污染的关系。将不同浓度的3种污染物分别添加至未受污染的土壤中，构建MFCs并运行，记录产电电压。MFCs结束运行后，从电压曲线中提取产电信号指标，与作为参照的传统微生物学指标的变化进行比较。同时采用循环伏安扫描对MFCs阳极室土壤的电化学活性进行测定;采用PCR-DGGE及克隆测序分析等分子生物学手段对MFCs阳极上的细菌群落进行分析，解释产电信号对污染响应的微生物学机理。实验结果显示:Cu2+、Cd2+或芘的添加均显著降低了产电信号指标产电量，Cu显著降低了产电信号指标电压峰值，Cd显著延长了产电信号指标启动时间。与未受污染对照相比，50 mg kg-1 Cu2+处理的产电量和电压峰值及50 mg kg-1 Cd2+处理的产电量显著降低;50 mg kg-1 Cd2+处理的启动时间显著增加。Cu污染实验中，产电量与脱氢酶活性(R2=0.91，P＜0.001)、底物诱导呼吸(R2=0.80，P＜0.001)和微生物生物量碳(R2=0.47，P＜0.001)均呈显著正相关。Cd污染实验中，启动时间和产电量与Cd2+浓度在0-400mg kg-1呈显著相关(P＜0.01)，在100 mg kg-1以下呈线性显著相关（启动时间:R2=0.943，P＜0.01;产电量:R2=0.937，P＜0.01）。Cu2+和芘的添加抑制了MFCs阳极室土壤的电化学活性。阳极细菌群落结构与土壤出现差异;Cu2+、Cd2+与芘的添加改变了MFCs阳极细菌的群落结构;Cd2+的添加显著降低了阳极细菌群落的多样性。土壤产电信号指标对污染物有着灵敏、线性的响应，其变化与传统微生物学指标一致，可能能够反映土壤污染状况。
　　本研究以不同种类植被恢复的侵蚀红壤作为检测对象，研究土壤产电信号与不同利用方式土壤微生物活性的关系。选取4种植被类型与未进行种植的侵蚀裸地，分别采集3个土样，构建MFCs并运行，记录产电电压，提取产电信号指标。MFCs运行结束后，采用高通量焦磷酸测序手段对MFCs阳极上的微生物群落进行分析。实验结果显示:未种植植被的侵蚀样品的土壤产电信号指标启动时间显著长于植被恢复样品，但不同土地利用方式土样的电压峰值和产电量没有显著性差异。启动时间与土样的脱氢酶活性(R2=0.381，P＜0.01)及微生物生物量碳(R2=0.368，P＜0.01)均显著线性负相关。启动时间与土样的有机碳(R2=0.324，P＜0.05)、可溶性有机碳(R2=0.232，P＜0.05)及腐殖质碳(R2=0.286，P＜0.05)含量均呈显著线性正相关。电压峰值和产电量与土壤化学性质或微生物活性均无显著相关。MFCs阳极细菌群落中，在门水平上厚壁菌门与变形菌门的相对丰度最高;在属水平上Clostridium的相对丰度最高，产电能力较弱的土样其Clostridium的相对丰度也较低。启动时间可能能够反映植被恢复侵蚀红壤的微生物活性，与土壤有机碳含量显著线性相关。
　　本论文结果显示土壤有机碳含量与产电量、电压峰值呈正相关;土壤混加葡糖糖后，与启动时间显著线性相关，其可能为土壤产电最重要的驱动因子。Clostridium在土壤Fe(Ⅲ)还原菌群落中相对丰度较高;在红壤MFCs阳极表面相对丰度较高;在分离获得的产电菌种占较高比例，其可能为土壤中占优势的产电菌群。产电信号指标启动时间与土壤污染物浓度及微生物活性均显著线性相关，具有反映土壤污染与微生物活性的潜在可能。

目录

声明

摘要

第1章 绪论

1．1 土壤产电技术

1．1．1 微生物燃料电池

1．2．2 土壤产电的影响因素及其应用

1．2 电化学活性微生物

1．2．1 已知的电化学微生物种类及来源

1．2．2 电化学活性微生物的分离与鉴定方法

1．2．3 电化学活性微生物的胞外电子传递机制

1．2．4 土壤源的电化学微生物研究进展

1．3 反映土壤污染的微生物指标

1．3．1 反映土壤污染的传统微生物指标

1．3．2 反映土壤污染的微生物传感器

1．3．3 现有检测方法的比较

1．4 本研究的内容及意义

1．4．1 研究背景及意义

1．4．2 研究内容及研究目标

1．4．3 拟解决的关键科学问题

1．4．4 技术路线

第2章 土壤产电与土壤性质及相关细菌群落的关系

2．1 前言

2．2．1 土样采集

2．2．2 土壤性质的测定

2．2．3 NFCs的构建与运行

2．2．4 Fe(Ⅲ)还原菌的富集

2．2．5 DNA的提取

2．2．6 高通量焦磷酸测序

2．2．7 数据分析

2．3 结果与分析

2．3．2 MFCs运行前后土壤性质的变化

2．3．3 不同类型土壤中与产电相关的细菌群落

2．3．4 土壤性质与土壤产电及相关细菌群落的冗余分析(RDA)

2．4 讨论

2．5 小结

第3章 土壤产电细菌的分离与鉴定

3．1 前言

3．2 材料和方法

3．2．1 土壤样品

3．2．2 Fe(Ⅲ)还原菌的富集与分离

3．2．3 菌株系统发育分类鉴定

3．2．4 菌株产电能力鉴定

3．2．5 MFCs内阻测定

3．2．6 菌株电化学活性测定

3．2．7 MFCs阳极细菌扫描电镜观察

3．2．8 数据分析

3．3 结果与分析

3．3．1 菌株的分类及其产电能力

3．3．2 菌株的菌种鉴定

3．3．3 菌株的产电性能

3．3．4 菌株的电化学活性

3．3．5 菌株的扫描电镜照片

3．4 讨论

3．4．1 菌株的胞外电子传递机制

3．4．2 菌株产电水平的分析

3．5 小结

第4章 土壤产电信号与土壤Cu及Cd污染的关系

4．1 前言

4．2 材料和方法

4．2．1 土壤样品及其理化性质

4．2．4 DHA、SIR和MBC测定

4．2．5 电化学活性测定

4．2．6 DNA的提取

4．2．7 PCR-DGGE、克隆测序和系统发育分析

4．2．8 数据分析

4．3 结果与分析

4．3．1 土壤产电信号对Cu污染的响应

4．3．2 土壤产电信号对Cd污染的响应

4．3．3 产电信号指标与传统微生物指标及重金属浓度的关系

4．3．4 Cu对MFCs阳极土壤电化学活性的影响

4．3．5 Cu、Cd对MFCs阳极细菌群落的影响

4．4 讨论

4．4．1 土壤产电信号的迅速生成

4．4．2 土壤产电信号反映重金属污染的可靠性

4．4．3 土壤产电信号相关的细菌群落

4．5 小结

第5章 土壤产电信号与土壤芘污染的关系

5．1 前言

5．2．1 供试土壤

5．2．2 芘胁迫实验

5．2．3 土壤产电信号测定

5．2．4 土壤脱氢酶活性测定

5．2．5 电化学活性测定

5．2．6 DNA的提取

5．2．7 PCR-DGGE、克隆测序和系统发育分析

5．2．8 统计分析

5．3 结果与分析

5．3．1 土壤产电信号对芘污染的响应

5．3．2 芘对MFCs阳极土壤电化学活性的影响

5．3．3 芘对MFCs阳极细菌群落的影响

5．4 讨论

5．4．1 土壤产电信号对芘污染响应的机理

5．4．2 土壤产电信号相关的细菌群落

5．5 小结

第6章 土壤产电信号与植被恢复侵蚀红壤微生物活性的关系

6．1 前言

6．2．1 采样地概况

6．2．2 土样采集

6．2．3 土壤性质测定

6．2．4 MFCs的构建和运行

6．2．5 DNA的提取

6．2．6 高通量测序

6．2．7 数据分析

6．3 结果与分析

6．3．1 植被恢复侵蚀红壤的微生物活性与化学性质

6．3．2 土壤产电信号及其与微生物活性的关系

6．3．3 MFCs阳极细菌群落的组成

6．4 讨论

6．4．1 土壤产电信号反映微生物活性的机理

6．4．2 土壤产电信号相关的主要菌群

6．5 小结

第7章 总结及展望

7．1 总结

7．2 研究特色与创新点

7．3 不足与展望

参考文献

附录

致谢