荷载多柔比星与氯喹的共递药纳米系统逆转多药耐药的效应及机制研究

摘要

目前临床治疗恶性肿瘤多采用综合手段，有手术、放射治疗、化学治疗。癌症的治疗中，药物治疗是一个很重要的环节，有效的抗癌药物的使用，可以帮助患者获得更长的生存时间，增加生存率。在上世纪60年代，联合化疗兴起，即在一个化疗疗程中同时或者先后使用数种化疗药物，是多种癌症治疗中广为使用的策略。目前，临床多种癌症治疗都有联合化疗方案。
　　基于联合化疗的理念，癌症治疗中共递药的研究越来越多。从所使用的药物的结构来分，可以是两种或多种小分子药物的共同递送，也可以是小分子药物与大分子药物的共同递送;从模式药物的作用机理来分，可以与联合化疗相同，即两种或多种药物均为抗癌药物，也可以是抗癌药物与增敏剂的组合递药。
　　近几年，在癌症治疗的研究中，共同递送化疗药物与化疗增敏剂的研究越来越多。化疗增敏或多药耐药逆转作用是指采用微小剂量的该种物质与化疗药物合用即能使化疗效果有显著提高。现今的化疗增敏剂主要包括:多药耐药(Multidrug Resistance，MDR)逆转剂，乏氧细胞杀伤剂，基因制剂，中药及其提取物等等。其中P-gp蛋白抑制剂的研究较为成熟，目前已出现第三代P-pg抑制剂。
　　基于自噬诱导的原理，抗癌药物联合自噬抑制剂的研究在最近几年也开始受到关注。自噬诱导是肿瘤细胞对化疗药物抵抗性的原因之一，当肿瘤细胞受到化疗药物刺激时细胞内自噬水平会明显增加，这是肿瘤细胞逃避化疗刺激的一种适应性反应。因此自噬能使肿瘤细胞对化疗药物产生耐受，抑制自噬将会增加肿瘤对化疗药物的敏感性。临床上，有用细胞毒化疗药物加自噬抑制剂用于联合化疗的治疗方法。
　　结合自噬抑制形成的抗癌增敏效果，以及纳米递药系统的优势，载有自噬抑制剂及抗癌药物的纳米共递药系统，可减少抗癌药物的使用剂量以及毒副作用，提高抗癌效果，逆转多药耐药。
　　目的：
　　我们设计并制备了一种单层双载药的纳米颗粒，命名为NPDOX+CQ。该纳米颗粒荷载两种药物，一种为抗癌药DOX，另一种为自噬抑制剂CQ。我们证实，NPDOX+CQ可阻止药物被P-gp识别和外排，在癌细胞的次级胞内体释放药物，CQ阻断自噬过程，使DOX得到保护，进而更多的分布到细胞核中。此外，我们还研究了纳米颗粒在胞内的具体转运过程，以及其对自噬相关蛋白表达的影响。该纳米颗粒为克服MDR提供了一种有效的策略。
　　方法：
　　1.制备表征:采用乳化溶剂挥发法制备PLGA/TPGS NPs以及NPDOX，NPCQ和NPDOX+CQ。对几种纳米颗粒的粒径和表面电位进行分析。通过扫描电子显微镜和透射电子显微镜观察纳分别观察几种纳米颗粒的表面形态和分散情况。通过漫反射傅里叶变换红外光谱(DR-FTIR)和X射线衍射(X-RD)检测药物的包载情况。使用UV-Vis分光光度计检测纳米颗粒的包封率和载药率，以及体外释放的情况。
　　2.生物效应:利用WST-1的方法测定PLGA/TPGS NPs对A549和A549/Taxol细胞的细胞毒性，以评估材料的安全性。用WST-1试剂盒分别测定DOX、DOX+CQ、NPDOX和NPDOX+CQ对A549和A549/Taxol细胞的细胞毒性，并计算IC50值，以评估纳米共递药系统对药物抗癌效果的改善情况。
　　3.细胞摄取与迁移:制备NPDOX+C6，用C6代替没有荧光特性的CQ，标记纳米颗粒。用激光共聚焦显微镜观察比较游离DOX在A549和A549/Taxol细胞中的外排情况，以及NPDOX+C6在A549/Taxol细胞中的摄取与迁移。
　　4.机理研究:用NPC6分别处理DsRed-Rab5质粒和DsRed-Rab7质粒转染的A549/Taxol细胞，用激光共聚焦显微镜观察纳米颗粒入胞后的转运情况，即纳米颗粒与两种荧光蛋白的位置关系。用WesteRN Blot检测不同组药物处理后，A549/Taxol细胞LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ的蛋白表达情况以及对各组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值的比较。
　　结果：
　　1.检测结果显示，纳米颗粒粒径均一且分散性良好，双载药纳米颗粒约为170nm。纳米颗粒带有负电荷，利于其在体内的运输。红外和X衍射的结果显示，两种药物被成功载入纳米颗粒中。纳米颗粒对两种药物都有较高的包封和载药效率。体外药物释放实验则显示，纳米颗粒具有pH敏感性，可在弱酸性的次级胞内体中释放药物。
　　2.体外细胞毒性实验的结果表明，纳米递药材料对A549和A549/Taxol两种细胞的细胞毒性很低，证明该材料基本是安全的。而药物的细胞毒性结果则表明，联合递送抗癌药物DOX及其增敏剂CQ，可改善抗癌疗效，减少药物的使用剂量，降低毒副作用。
　　3.药物外排实验结果显示，游离的DOX可进入A549细胞的细胞核，但最终也有少量外排。而对于A549/Taxol细胞而言，游离DOX不可进入其细胞核，只在2h-6h时靠近其细胞核，但最终又被外排出细胞。制备NPDOX+C6用于荧光成像。结果显示，两种药物被递送到A549/Taxol细胞中。从6h-24h表明越来越多的DOX迁移并聚积到细胞核内。这表明，纳米颗粒可避免P-gp底物的药物外排，利于其在细胞核内的聚积。
　　4.机理研究结果表明，纳米颗粒进入细胞后通过自噬流进行转运。CQ可在自噬晚期发挥作用，保护DOX免受降解，使其更多的进入细胞核发挥抗癌作用。Western Blot结果显示，与其他各组制剂相比，双载药纳米颗粒组具有最好的自噬抑制效果，可使DOX最大限度的发挥其药效，改善抗癌效果。
　　结论：
　　在本研究中，我们设计并制备了单层双载药的纳米颗粒，荷载了抗癌药物DOX以及自噬抑制剂CQ。CQ作为DOX的抗癌增敏剂，可阻止次级胞内体与溶酶体的结合，在纳米颗粒通过自噬流转运的过程中，保护DOX使其不被细胞自噬过程降解，从而更多的聚积于细胞核中，杀灭肿瘤细胞。减少了抗癌药物的使用剂量，减少了毒副作用，提高了抗癌效果，逆转了多药耐药。

目录

声明

摘要

缩略语表(Abbreviations)

第一部分 文献综述

第一章 联合化疗与共递药纳米系统

1 联合化疗

2 共递药纳米系统

3 共递药纳米系统面临的挑战与应对策略

第二章 自噬与肿瘤

1 肿瘤发生现状

2 自噬现象及其与肿瘤的关系

第三章 自噬相关共递药的组成及主要生物效应

第二部分 实验研究

第一章 空载纳米颗粒的制备及表征

1 前言

2 实验材料

3 实验方法

4 结果

5 讨论

第二章 载药纳米颗粒的制备及表征

1 前言

2 实验材料

3 实验方法

4 结果

5 讨论

第三章 体外细胞毒性研究

1 前言

2 实验材料

3 实验方法

4 结果

5 讨论

第四章 纳米颗粒的细胞摄取和胞内迁移

1 前言

2 实验材料

3 实验方法

4 结果

5 讨论

第五章 纳米颗粒逆转MDR机理研究

1 前言

2 实验材料

3 实验方法

4 结果

5 讨论

结论

参考文献

在读期间发表的学术论文及研究成果

致谢