中华绒螯蟹微孢子虫的鉴定及流行病学调查

摘要

中华绒螯蟹(俗称河蟹，Eriocheir sinensis)是近些年养殖与消费的热点，发展非常迅速，已成为最具特色、最具潜力的水产养殖品种，具有极高的食用价值和经济价值。江苏是全国中华绒螯蟹养殖大省，区域优势明显。但近几年暴发的“肝胰腺坏死症”对中华绒螯蟹养殖业造成了巨大损失，影响了该产业的健康发展。研究表明中华绒螯蟹微孢子虫（Hepatosporaeriocheir）与疫情的发生密切相关，本论文围绕H eriocheir的形态学鉴定、侵染病理特征及重点区域的流行情况开展了系列研究，具体包括:
　　1、中华绒螯蟹微孢子虫的形态学鉴定
　　对中华绒螯蟹微孢子虫的形态结构进行鉴定，是开展进一步研究的前提条件和基础。经Masson染色后观察到肥大的和深染的嗜酸性粒状体。观察未经染色的组织拓片，结果显示，与正常的细胞相比，感染微孢子虫的肝胰腺细胞内充满大量孢子并形成包涵体。通过负染技术证明成熟孢子呈圆形，直径为0.8±0.1tm，孢子前端特征性的锚定样凸起(anchor disc)结构明显，这与以前的结果一致。
　　2、中华绒螯蟹微孢子虫的显微及超微病理分析
　　本部分分别从光镜和电镜水平上开展研究。光镜水平下，通过石蜡切片及H.E染色，发现微孢子虫感染后，中华绒螯蟹肝胰腺出现了局部炎症，包括细胞核肥大，血细胞聚集成结，上皮细胞脱落等。电镜水平下，通过超薄切片观察发现微孢子虫感染后，中华绒螯蟹肝胰腺细胞核周边有大量的线粒体聚集现象，表示微孢子虫依赖寄主肝胰腺细胞的线粒体提供能量;丝状的微孢子虫前体出现并充满整个细胞;微孢子虫包被一层厚厚的细胞壁，表示其发育成熟。
　　进一步建立了特异性原位杂交(In Situ Hybridization,ISH)检测方法，结果表明，自行设计、合成的地高辛标记的寡核苷酸探针可以较好地与中华绒螯蟹细胞内寄生的微孢子虫特异性地结合，经二甲基联苯胺(DAB)染色后阳性区域呈深棕色（部分区域染色太深显示黑色），正常细胞核经苏木精染色呈蓝色，而所检测健康中华绒螯蟹无特异性信号。
　　3、江苏省部分地区中华绒螯蟹微孢子虫的流行病学调查
　　针对这一重要病害，对典型发病区开展跟踪调查研究及持续监测，分析微孢子虫在我省部分中华绒螯蟹养殖区的流行状况。结果显示，2016年各监测区养殖的中华绒螯蟹都有很明显的肝胰腺白化或坏死症状，PCR检测濒死中华绒螯蟹肝胰腺为微孢子虫阳性;序列比对结果表明其与H eriocheir有99.77％的相似性;而2017年该病的发生率较往年显著回落，各监测区内微孢子虫检测阳性率较低。

目录

声明

摘要

缩略词表

第1章绪论

1．1中华绒螯蟹概述

1．1．1形态特征

1．1．2地理分布

1．1．3生活习性和生长

1．1．4养殖产业发展现状

1．2微孢子虫(Microsporidian)的生物学特性及研究概况

1．2．3微孢子虫的形态结构

1．2．4微孢子虫的生活周期

1．2．5微孢子虫的入侵机制

1．3微孢子虫的流行特征

1．3．1地理分布

1．3．2水生动物间的传播途径

1．3．3发病症状

1．3．4微孢子虫研究现状及危害

1．3．5中华绒螯蟹微孢子虫病害防治措施

1．4微孢子虫的的诊断方法

1．4．1镜检技术

1．4．2分子生物学诊断

1．5本论文研究意义目的、内容与技术路线

1．5．1研究意义、目的

1．5．2研究内容

1．5．3技术路线

2．1引言

2．2实验材料

2．2．1实验仪器与设备

2．2．2实验试剂及配制

2．2．3样品采集

2．3实验方法

2．3．1石蜡切片制备

2．3．2 Masson染色

2．3．3组织拓片

2．3．4负染样品处理

2．4实验结果

2．4．1 Masson染色鉴定中华绒螯蟹微孢子虫的形态

2．4．2组织拓片鉴定中华绒螯蟹微孢子虫的形态

2．4．3电镜负染鉴定中华绒螯蟹微孢子虫的形态

2．5讨论

第3章中华绒螯蟹微孢子虫的显微及超微病理分析

3．1引言

3．2实验材料

3．2．1实验仪器与设备

3．2．2实验试剂及配制

3．2．3样品采集

3．3实验方法

3．3．1石蜡切片制备

3．3．2苏木精-伊红染色(Hematoxylin-eosin staining，H．E)染色

3．3．3透射电镜样品处理

3．3．4原位杂交

3．4实验结果

3．4．1患病中华绒螯蟹显微病理

3．4．2患病中华绒螯蟹超微病理

3．5讨论

第4章江苏省部分地区中华绒螯蟹微孢子虫流行病学调查

4．1引言

4．2调查对象

4．3调查方法

4．3．1仪器设备

4．3．2材料试剂

4．3．3引物设计与合成

4．3．4 PCR检测

4．4调查结果

4．4．1 2016年江苏省中华绒螯蟹微孢子虫疫病监测点情况统计

4．4．2 2017年江苏省中华绒螯蟹微孢子虫疫病监测点情况统计

4．5讨论

第五章全文总结与展望

5．1本研究的主要成果和结论

5．2展望

参考文献

在读期间发表的学术论文及研究成果

致谢