抗B7-H4-scFv/PE38KDEL重组免疫毒素的表达和功能性检测

摘要

本研究通过SOE-PCR技术将抗B7-H4单链抗体基因与毒素PE38KDEL基因进行连接，将得到的重组免疫毒素基因anti-B7-H4-scFv-PE38KDEL亚克隆到原核表达载体pET28a中诱导表达。重组免疫毒素先通过变复性得到可溶蛋白，在经过镍柱纯化得到较单一的目的蛋白，并用免疫印迹鉴定蛋白的表达情况;后分别利用间接ELISA、流式细胞术和Western blot检测重组蛋白与B7-H4抗原的结合活性;通过MTT法和皮下异种移植瘤模型实验，检测毒素蛋白对体外、内肿瘤细胞的抑制作用，处死荷瘤鼠后，解剖瘤块并对肿瘤组织进行HE染色和免疫组化分析。具体实验流程如下:
　　1、重组免疫毒素anti-B7-H4-scFv-PE38KDEL基因的扩增、克隆和重组表达载体pET28a/anti-B7-H4-scFv-PE38KDEL的构建
　　先分别扩增出单链抗体anti-B7-H4-scFv基因和修饰后的毒素PE38KDEL基因，再利用SOE-PCR技术将这两段基因连接。PCR反应结束后，将目的条带进行割胶回收。将回收的目的基因anti-B7-H4-scFv-PE38KDEL与pUM19-T Vector按照试剂盒进行T-A克隆，保留测序结果正确的菌株。用EcoRⅠ和NotⅠ限制性内切酶对pET28a(+)质粒和anti-B7-H4-scFv-PE38KDEL基因进行双酶切。所得的连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞中，涂含抗生素的平板进行筛选，次日挑取平板上长出的阳性克隆送测鉴定，测序正确的阳性菌株-80℃保存。
　　2、重组免疫毒素Anti-B7-H4-scFv-PE38KDEL的表达、纯化及活性检测
　　将含有正确pET28a/anti-B7-H4-scFv-PE38KDEL重组载体质粒的BL21(DE3)表达菌株在不同条件下诱导表达。利用SDS-PAGE分析蛋白在不同条件下的表达情况，并找出最优表达条件。在最优的条件下扩大培养并收集产物，将所得的包涵体沉淀进行变复性处理，以获得更多的可溶性上清。表达产物带有His标签可与镍柱结合，以此纯化蛋白，并用不同浓度的咪唑洗脱并收集洗脱液。把洗脱的蛋白液进行透析，浓缩，收集及鉴定。间接ELISA鉴定重组毒素蛋白和B7-H4抗原蛋白的亲和活性;采用间接荧光标记的方法，运用流式细胞术检测免疫毒素对人源乳腺癌细胞MCF-7、正常人肾皮细胞293a和人源肝癌细胞HepG2这3种细胞的结合活性。
　　3、重组毒素蛋白Anti-B7-H4-scFv-PE38KDEL在体外和体内的生物学功能鉴定
　　分别从体内和体外两部分实验检测重组毒素蛋白的生物学功能，体外利用MTT实验在5个浓度梯度(0.01、0.10、1.00、10、100ug/ml)下，分别在12h、24h、36h和48h测定重组毒素对B7-H4抗原高表达的肺癌细胞A549、少表达的肝癌细胞HepG2和不表达的正常细胞293T细这三种细胞增殖的影响。利用台盼蓝染色检测毒素蛋白（0.01、1.00、100ug/ml）对MCF-7、HepG2、293a三种细胞的作用，并计算存活率。体内实验建立小鼠肿瘤异种移植模型，将人源肺癌A549细胞调整到一定数量注射到小鼠皮下建立模型，待瘤长到一定大小时，随机分为空白对照组、阳性对照组和实验组，空白对照组注射生理盐水，阳性对照组注射紫杉醇，实验组注射抗体蛋白，连续隔天给药，一共注射七次，期间记录小鼠体重和肿瘤体积变化。最后处死荷瘤鼠，对取出的瘤组织进行称重、固定，并进行HE染色和免疫组织化学分析。

目录

声明

缩略词表

摘要

引言

第一部分 文献综述

第一章抗B7-H4单链抗体的研究

1．3 B7-H4分子在相关疾病方面的研究

1．4单链抗体的简介

1．5单链抗体在肿瘤导向治疗中的作用

1．6单链抗体与免疫毒素的联系

1．7小结

参考文献

第二章重组免疫毒素的研究

2．1免疫毒素的概念

2．2免疫毒素组成部分的选择和类型

2．3免疫毒素的作用机制

2．4免疫毒素面临的问题

2．5免疫毒素的前景与展望

2．6小结

参考文献

第三章PE类重组毒素的研究

3．1 PE类毒素的概念及分子组成

3．2 PE类毒素的衍生物

3．3 PE类毒素的作用机制

3．4 PE类毒素的应用

3．5小结

参考文献

第二部分实验研究

第四章重组毒素表达载体pET28a-anti-B7-H4-scFv-PE38KDEL的构建和克隆

4．1实验材料

4．2实验方法与材料

4．3结果与分析

4．4讨论

参考文献

第五章重组免疫毒素Anti-B7-H4-scFv-PE38KDEL的表达、纯化及活性检测

5．1实验材料及试剂

5．2实验方法

5．3实验结果

5．4讨论

参考文献

第六章重组毒素蛋白Anti-B7-H4-scFv-E38KDEL体外和体内的生物学功能检测

6．1实验材料及试剂

6．2实验方法

6．3结果

6．4讨论

参考文献

第三部分全文总结

附录

致谢