极性钙胁迫对花鳗鲡钙稳态相关基因表达及血液指标的影响

摘要

钙离子(Ca2+)在生物体中扮演重要的角色。体内Ca2+平衡的紊乱影响多种分子和细胞过程，最终会导致许多疾病发生。哺乳动物体内Ca2+平衡的调节与Ca2+吸收多发生在小肠、肾脏和骨骼组织。而在鱼体内Ca2+的吸收与交换主要发生在鳃组织。海水中存在着大量Ca2+，其浓度在海水表层和深水中变动很大。为维持正常的生理活动，鱼体内Ca2+浓度需维持在一定的范围之内。花鳗鲡(Anguilla marmorata)属于洄游性鱼类，在洄游过程中需要适应不同Ca2+浓度环境的变化。为了探究花鳗鲡应对极性Ca2+浓度下体内的应激机制，本研究系统检测了花鳗鲡成鳗从对照组(2mM Ca+)转移到高钙组(10mM Ca2+)和缺钙组(0mM Ca2+)时第1、4和7天钙稳态相关基因（CACNBs、NCXs和PMCAs）的表达规律和血清钙浓度、血清钠浓度、血清渗透压和5项血液指标（白细胞数目、红细胞数目、葡萄糖浓度、血红蛋白浓度和血小板数目）的变化规律，研究结果为进一步研究花鳗鲡钙稳态调节的分子机制提供理论依据。主要研究结果如下:
　　(1)极性钙胁迫下花鳗鲡CACNBs基因的体内外表达分析
　　采用qRT-PCR、Western blot、免疫组化和鳃细胞培养技术对电压门控L型Ca2+通道基因(CACNB1、CACNB2和CACNB3)进行体内外时序表达分析。Western blot组织表达结果显示CACNB基因3种亚型在鳃组织高表达，而mRNA组织表达结果显示CACNB1和CACNB3在皮肤组织高表达，CACNB2在肠组织高表达。时序表达结果显示，CACNB1的mRNA和蛋白表达在高钙(10mM)中上调，在缺钙(0mM)中下调。然而，CACNB2和CACNB3却出现相反的结果，在低钙中上调，在高钙中下调。到第7天，CACNB1与周围钙浓度正相关显著表达，CACNB2的表达相对于对照组无显著变化，而CACNB3与周围钙浓度负相关显著表达。体外时序表达验证了以上结果。由此可判断CACNB1具有高钙指示作用，CACNB2具有钙稳态作用，CACNB3具有低钙指示作用。
　　(2)极性钙胁迫下花鳗鲡NCX和PMCA基因不同时空的差异表达
　　采用qRT-PCR技术对钠钙交换体NCXs和质膜Ca2+泵PMCAs基因在花鳗鲡13种不同组织（脑、鳃、头肾、后肾、前肠、中肠、后肠、肝、心、肌肉、鳔、脾、皮肤）的表达进行分析;并研究了花鳗鲡应对极性Ca2+浓度下NCXs和PMCAs基因在第1、4和7天在鳃组织的表达变化规律。结果表明:NCX2和NCX3在皮肤组织表达最高，而NCX1、PMCA2和PMCA4在肾脏组织表达最高;NCX1和PMCA4最初在极性Ca2+处理情况下相较对照组有显著性差异，在第7天，NCX1与周围Ca2+浓度正相关显著表达，PMCA4的表达相对于处理组无显著变化。而其它亚型随着时间的增长均无显著性差异变化。由此可见，NCX1和PMCA4在Ca2+调控中也扮演重要的角色。
　　(3)极性钙胁迫下花鳗鲡血清和血液指标的变化
　　采用原子吸收光谱法检测血清中Ca2+和Na+浓度，结果显示:随着时间的延长，花鳗鲡高钙环境下血Ca2+浓度逐渐降低，低钙环境下血Ca2+浓度逐渐升高，在第7天，处理组Ca2+浓度与对照组无显著差异，出现钙稳态现象;而高钙环境下血Na+浓度随着时间延长逐渐升高，低钙环境下血Na+浓度随着时间延长逐渐降低，在第7天，处理组Na+浓度与对照组差异显著，无稳态现象。采用蒸汽压渗透压计检测血清渗透压，结果显示:随着时间增长，高钙环境下血清渗透压逐渐降低，低钙环境下血清渗透压逐渐升高，第7天，处理组血清渗透压与对照组无显著差异，出现钙稳态现象。采用自动血液分析仪测定红细胞数目、白细胞数目和血小板数目，采用标准试剂盒测定葡萄糖浓度和血红蛋白浓度，结果显示:花鳗鲡的5项血液指标在高钙环境下随着时间的延长呈下调趋势;在缺钙环境下5项血液指标随着时间延长呈上升趋势，5项血液指标在第7天无显著差异，出现稳态现象。由此可见，花鳗鲡体内存在一种钙稳态调节机制来调节机体血清血液指标的平衡。

目录

声明

摘要

第一章绪论

1．1．2鳗鲡生活史与种质资源

1．1．3花鳗鲡的研究现状

1．2鱼鳃细胞的主要类型和研究进展

1．2．1鱼上皮鳃细胞的分类

1．2．2鱼上皮鳃细胞的研究进展

1．3钙稳态

1．3．1哺乳动物的钙稳态

1．3．2鱼类的钙稳态

1．3．3钙离子转运体

1．4本论文研究目的、意义和主要内容

1．4．1本研究的目的和意义

1．4．2本研究的主要内容

1．4．3研究技术路线

第二章极性钙胁迫下花鳗鲡CACNB基因体内外表达分析

2．1．2实验仪器设备

2．1．3实验试剂

2．2实验方法

2．2．1人工钙离子水的配制

2．2．2原代鳃细胞的胁迫处理及样本采集

2．2．3花鳗鲡组织与鳃细胞总RNA提取和反转录

2．2．4荧光定量PCR检测CACNB基因的表达量

2．2．5蛋白质免疫印迹

2．2．6免疫组化

2．2．7数据处理与分析

2．3结果与分析

2．3．1 CACNB基因组织分布差异表达

2．3．2极性钙胁迫下花鳗鲡CACNB的mRNA时序表达

2．3．3极性钙胁迫下花鳗鲡CACNB的蛋白时序表达

2．3．4极性钙胁迫下花鳗鲡CACNB的蛋白定位

2．3．5极性钙胁迫下不同时间的细胞密度

2．3．6极性钙胁迫对原代鳃细胞CACNB基因的影响

2．4讨论

第三章极性钙胁迫下花鳗鲡NCX和PMCA基因不同时空的差异表达

3．1实验材料、仪器与试剂

3．1．1实验材料

3．1．2实验仪器设备

3．1．3实验试剂

3．2实验方法

3．2．1人工钙离子水的配制

3．2．2总RNA提取和反转录

3．2．3荧光定量PCR检测NCXs和PMCAs基因的表达量

3．2．4数据处理与分析

3．3结果与分析

3．3．1 NCXs和PMCAs基因组织分布差异表达

3．3．2极性钙胁迫下花鳗鲡NCXs和PMCAs的mRNA时序表达

3．4讨论

第四章极性钙胁迫对花鳗鲡血清和血液指标的影响

4．1实验材料、仪器与试剂

4．1．3实验试剂

4．2实验方法

4．2．1人工钙离子水的配制

4．2．2不同浓度钙胁迫处理及样本采集

4．2．3数据处理与分析

4．3结果与分析

4．3．1极性钙胁迫下花鳗鲡血清钙浓度和血清渗透压的变化规律

4．3．2极性钙胁迫对花鳗鲡血液指标的影响

4．4讨论

第五章小结

5．1结论

5．2展望

参考文献

在读期间发表的学术论文及研究成果

致谢