长链非编码RNA Gm10768在肝脏糖异生中的作用与机制研究

摘要

肝脏是维持机体葡萄糖稳定的最重要组织器官，可以通过糖原分解和糖异生两种方式增加葡萄糖的输出、调节血糖稳定。糖异生是指利用乳酸、丙酮酸、甘油、生糖氨基酸等底物生成葡萄糖的过程，肝脏是糖异生的主要场所。病理状态下，肝脏糖异生被过度激活引发高血糖，是导致2型糖尿病(Type2diabetes，T2DM)的主要原因。肝脏糖异生除受营养信号和激素水平的调节外，肝脏糖异生关键控制酶的转录活性是调控糖异生水平的关键。因此，揭示肝脏糖异生关键控制酶的转录调控因子，寻找有效抑制肝脏过度糖异生、减少内源性葡萄糖生成的方法，将有望为T2DM临床防治提供新的干预靶标。
　　长链非编码RNA(Long noncoding RNA，lncRNA)是一类长度在200nt以上无蛋白编码能力的RNA。已证实lncRNA可以在转录前、转录后、表观遗传学等多个层面参与生命活动调控。新近发现lncRNA在调控葡萄糖稳态，参与代谢性疾病如2型糖尿病等的发生中同样起重要调节作用。LncRNA Meg3过表达可显著增加肝脏葡萄糖生成，而肝脏特异性沉默Meg3则有助于恢复糖尿病造成的小鼠葡萄糖代谢损伤;另一条可以被饥饿诱导的lncRNA lncLGR，已被证实可以通过结合异质核糖核蛋白L，抑制葡萄糖激酶活性以及糖原的存储，参与机体葡萄糖代谢调节。鉴于lncRNA数量众多，在肝脏糖代谢研究中的报道依然较少，因此仍有大量功能未知的lncRNA有待于进一步挖掘。
　　第一部分 基于高通量测序技术的肝脏糖异生相关lncRNA的筛选
　　以“饥饿-再进食”小鼠模型为研究对象，取肝脏组织采用高通量测序技术筛选糖异生相关lncRNA。测序结果显示，在正常饮食组和16h饥饿组共计测得的lncRNA数量分别为28，312和31,947。进一步我们设置:1.与16h饥饿组比在正常饮食组小鼠肝脏表达水平上调3倍以上;2.丰度高、测序读数(Counting reads)＞500;3.已被GenBank注释为lncRNA等参数进行筛选。结果显示仅Gm15441，4833411C07Rik,Gm10768和4931408D14Rik符合上述筛选标准。采用定量PCR检测发现，4条lncRNA不仅在受饥饿诱导的小鼠肝脏组织中表达显著上调，而且再进食后表达可以迅速回落到正常水平，但是只有4833411C07Rik和Gm10768高表达于糖异生被过度激活的db/db小鼠肝脏组织中，提示二者可能参与肝脏糖异生调控。因此，进一步采用RNAi的方法，沉默二者在原代分离小鼠肝细胞中的表达，明确4833411C07Rik和Gm10768与糖异生调控关系。结果发现，Gm10768沉默后，细胞葡萄糖输出能力显著降低，提示其可能参与肝脏糖异生，而4833411C07Rik无显著影响。因此，初步锁定Gm10768作为深入研究的对象。
　　第二部分 长链非编码RNA Gm10768在肝脏糖异生中的作用与机制研究
　　通过体外和体内实验揭示Gm10768在调控肝脏糖异生中的作用。Gm10768过表达可增强原代小鼠肝细胞葡萄糖生成能力，上调糖异生相关限速酶PEPCK(Phosphoenolpyruvate carboxykinase)和G6Pase（Glucose-6-phosphatase）表达;在体水平特异性上调肝脏组织中Gm10768表达可激活糖异生，上调小鼠血液葡萄糖和胰岛素水平，降低小鼠葡萄糖耐受性和胰岛素敏感性。Gm10768表达沉默则可以下调原代分离小鼠肝细胞中PEPCK和G6Pase表达，在体水平特异性沉默肝脏组织中Gm10768表达可抑制糖异生，下调小鼠血液葡萄糖和胰岛素水平，增强小鼠葡萄糖耐受性和胰岛素敏感性。此外，在糖尿病db/db小鼠模型中特异性沉默肝脏组织中Gm10768表达，小鼠的高血糖症状、葡萄糖耐受性和胰岛素耐受性均明显得到改善。我们还发现Gm10768的糖异生调控作用可能与miR-214有关，以往研究证实miR-214可以通过调控ATF4（Activating transcription factor4）表达参与肝脏糖异生。Gm10768可以发挥ceRNA(Competing endogenous RNA)功能，降低miR-214对ATF4的抑制作用，上调ATF4表达参与肝脏糖异生调控。

目录

声明

摘要

第1章 绪论

1．1 肝脏与葡萄糖代谢

1．2 肝脏与糖异生

1．3 肝脏糖异生的调控因素

1．3．1肝脏糖异生受生糖底物的调控

1．3．2 糖异生受糖异生相关酶活性的调控

1．3．3 糖异生受转录调节因子和转录共剌激因子的调控

1．3．4 糖异生受肝脏代谢信号的调控

1．3．5 糖异生受内质网应激的调控

1．3．6 糖异生受激素水平的调控

1．4 长链非编码RNA的定义、特征与分类

1．5 长链非编码RNA的可能作用机制

1．5．1 细胞核lncRNA的作用机制

1．5．2 细胞质lncRNA的作用机制

1．6 长链非编码RNA与葡萄糖稳态以及糖尿病并发症

1．6．1 印记基因H19

1．6．2 母系表达基因3

1．6．3 心肌梗塞相关转录本MIAT

1．6．4 长链非编码RNA E33

1．7 本章小结

第2章 基于高通量测序技术的肝脏糖异生相关lncRNA的筛选

2．1 引言

2．2 材料与方法

2．2．1 实验材料

2．2．2 实验方法

2．3 实验结果

2．3．1测序所得序列与小鼠基因组比对结果统计

2．3．2 测序所得lncRNA表达差异分析

2．3．3 定量PCR方法验证候选lncRNAs在“饥饿-再进食”模型小鼠肝脏组织中的表达

2．3．4 定量PCR方法检测候选lncRNAs在糖尿病db/db小鼠肝脏中的表达

2．3．5 4833411C07Rik和Gm10768表达沉默对小鼠原代肝细胞葡萄糖生成能力的影响

第3章 长链非编码RNA Gm10768在肝脏糖异生中的作用与机制研究

3．1 引言

3．2 材料与方法

3．2．1 实验材料

3．2．2 实验方法

3．3 实验结果

3．3．1 Gm10768作为长链非编码RNA的基本特征

3．3．2 糖异生信号诱导原代小鼠肝细胞中Gm10768的表达

3．3．3 Gm10768过表达激活糖异生促进肝细胞葡萄糖输出

3．3．4 Gm10768过表达激活C57BL/6J小鼠肝脏糖异生影响葡萄糖代谢

3．3．5 Gm10768沉默抑制糖异生降低肝细胞葡萄糖输出

3．3．6 Gm10768沉默抑制C57BL/6J小鼠肝脏糖异生影响葡萄糖代谢

3．3．7 肝脏特异性沉默Gm10768改善糖尿病db/db小鼠葡萄糖代谢

3．3．8 糖异生信号增加肝细胞细胞质中Gm10768含量

3．3．9 Gm10768过表达下调糖异生相关miR-214和miR-22的表达

3．3．10 Gm10768通过序列亲和作用招募miR-214

3．3．11 Gm10768招募miR-214发挥ceRNA功能调控肝脏糖异生

3．3．12 Gm10768竞争性结合miR-214影响ATF4的表达

第4章 结论与展望

附录

参考文献

在读期间发表的学术论文及研究成果

致谢