抗鸡大肠杆菌的1型菌毛的单克隆抗体的研究和pilA基因的融合表达及其重组菌毛蛋白免疫原性研究

摘要

1，提取JM10大肠杆菌菌毛，经12﹪的聚丙烯酰胺凝胶电泳。切取菌毛蛋白条带制成油乳剂抗原，免疫BALB/c小鼠，取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，经间接ELISA筛选获得2株能稳定分泌针对1型菌毛的单克隆抗体杂交瘤细胞株。单抗阻断甘露糖敏感血凝试验和Westernblot试验证明，这两株单抗都是1型菌毛特异的。这2株单抗的直接凝集价分别为25～26、28～29，ELISA效价分别为103、104～105。应用这2株单抗对46株带1型菌毛的禽病原性大肠杆菌优势血清型分离株进行了检测，单抗可以快速，简便的鉴定致病性的分离株，同时还可为后来的抗原性检测试验提供标准菌毛抗体。　　2.根据人大肠杆菌的pilA序列设计一对引物，从基因组中扩增大小为551bp目的基因pilA，定向克隆到T载体质粒，测序，然后克隆到表达载体pET-32a(+)中。阳性重组质粒转化至BL21(DE3)中，经IPTG诱导，SDS-PAGE检测，接着，对此重组菌株的表达条件从表达的情况、表达时间、IPTG的浓度等各方面进行优化.从而确立高效表达的条件。利用镍柱，提纯JM10菌株1型菌毛结构基因的重组蛋白。通过间接ELISA和Western-blot方法，与相应的单抗4D3和相关血清型O78的单抗和血清型O18的多价抗血清反应，试验结果证实该重组pilA基因重组蛋白具有菌毛蛋白的抗原性，存在交叉反应，进一步的说，1型菌毛之间存在相同的抗原位点，有一定的相关性。　　3.将提纯的重组蛋白和天然菌毛疫苗免疫小鸡，第三周，用同源致病性菌株气囊攻毒。同时设立非免疫鸡只攻毒对照，和非免疫非攻毒对照。观察鸡只的情况。攻毒4日后，非免疫攻毒组87.5﹪死亡。重组菌毛免疫组死亡率为25﹪，天然菌毛免疫组死亡率仅为12.5﹪，而天然菌毛疫苗的保护率高达87.5﹪。所有试验组鸡群剖解，从肝、心和气囊等部位观察机体的病理变化，免疫攻毒的两组鸡群且在肝脏、心包、气囊的病变比未免疫鸡显著轻微，重组菌毛免疫组比天然菌毛免疫组症状显著。从而说明，重组蛋白具有免疫保护作用。重组菌毛疫苗的保护力比天然菌毛疫苗低。

目录

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第一章1型菌毛的研究进展

一 概述

二 菌毛的组成及其形态结构

三 菌毛的表达

四 菌毛的生物学特性

五 菌毛的检测方法

六 菌毛在感染中的作用

七 菌毛基因簇结构

八 菌毛的免疫特性

第二章禽病原性大肠杆菌1型菌毛单克隆抗体的研制及其初步应用

摘要

前言

1材料

2方法

3结果

4讨论

附录1

第三章鸡源致病性大肠杆菌1型菌毛pilA基因的表达

摘要

前言

1材料

2方法

3结果

4讨论

附录2

第四章鸡致病性大肠杆菌1型菌毛pilA重组蛋白免疫原性研究

摘要

前言

1材料

2方法

3结果

4讨论

全文总结

参考文献

致谢