中国二斑叶螨和朱砂叶螨种群分子遗传结构的研究

摘要

二斑叶螨Tetranychus urticae(Koch)和朱砂叶螨T.cinnabarinus(Boisduval)同属蛛形纲Arachnida、蜱螨亚纲Acari、真螨目Acariformes、叶螨科Tetranychidae、叶螨属Tetranychus，广泛分布于世界各地，它们不但危害果树，还危害各类经济作物、林木、温室栽培植物和观赏植物等，是农林生产中重要的害螨种类。前者自Akl983年进入中国后，目前分布于中国东北、华北、西北及苏皖两省北部，危害多种果树及经济植物，在山东、辽宁、陕西等省已上升成为果树的第一大害螨，严重威胁果树业生产；后者是我国分布最广、发生最严重的一种农业害螨，在各地严重危害棉花、豆类、桑、木薯、木瓜、瓜类以及林木、温室栽培植物和多种观赏植物，对寄主植物产生机械伤害和毒害作用，引起植物减产和品质下降。由于二者扩散迅速、世代周期短、发育进度快、繁殖能力强，所以极易在新的环境定殖，形成新的地理种群。本文采用DNA序列分析法，分别对采自中国不同地区的二斑叶螨与朱砂叶螨的线粒体DNA COl基因序列以及核糖体DNA ITS2序列进行比较，分析二斑叶螨和朱砂叶螨各地理种群问的分子遗传结构，并对二者之间在分子水平上的差异进行深入探讨。 一、试验材料的采集和饲养 在全国范围内选择较有代表性的地区分别对二斑叶螨和朱砂叶螨进行采样，二斑叶螨采集于全国13个省、市、自治区，朱砂叶螨采集了27个地理种群，采集的生境主要是果园、花圃和蔬菜地。实验室内采用隔水法在菜豆(Phaseolusvulgaeia L.)叶片上进行恒温恒湿隔离饲养，饲养条件为25±1℃，L16：D8，相对湿度60％。 二、 测定COI和ITS2的序列，并对各不同地理种群进行比较 mtDNA是研究分子遗传和分子进化的一种重要模式体系，各基因区域被广泛用于分析昆虫不同分类水平的系统发育关系，其中细胞色素氧化酶I(COI)基因经常被用来分析亲缘关系较近的种、种下分类阶元以及地理种群之间的系统关系。核糖体DNA(rDNA)第2内转录间隔区(ITS2)中度保守，在昆虫和螨类的近缘种区分上应用较多。借鉴别的昆虫或蜱螨的mtDNA中COI以及核糖体DNA的ITS2的测定方法，测定所有种群的COI和ITS2序列。每个地理种群随机抽取3～5个样本进行序列测定，以它们的一致序列为准。 利用“BLAST”工具(NCBI站点)对测定的序列进行分析、DNA序列检索；用GenDoc软件进行序列同源性比较；用BioEdit软件进行序列编辑；用ClustalX软件进行序列比较(alignment)；比对结果输入MEGA2.1软件，采用距离法计算各样品间的遗传距离，并基于Kimura-2 Parameter模型，用邻接法(Neighbor-Joining,NJ)构建系统发育树，通过自展1000次检验获得系统树分支的置信度。三、基于线粒体DNA-COI基因序列，对我国二斑叶螨和朱砂叶螨各地理种群进行系统发育分析 测定了我国二斑叶螨13个地理种群和朱砂叶螨27个地理种群的mtDNA细胞色素氧化酶亚基COI的中央片段序列，最终从这些地理种群中都扩增出了453bp的COI基因片段。在获得的二斑叶螨COI序列比较中我们发现：整个序列共有36个碱基位点具有多样性，占全长的7.9％，其中88.9％为沉默替换；除新疆种群外，其他12个种群相互间的核苷差异都低于1.77％；新疆种群与其他12个种群的核苷差异平均为4.68％。朱砂叶螨种内核酸差异分析显示整个序列共有86个碱基位点具有多样性，占全长的19.0％，其中89.5％为沉默替换。利用邻接法(neighbor-joining，NJ)构建系统发育树，我们发现：二斑叶螨各地理种群中，新疆种群和其他的12个种群亲缘关系较远，在两个不同的支序上，因此，中国的二斑叶螨可以分为两个不同的世系；二斑叶螨的新疆种群与地中海种群亲缘关系较近，在同一个支序上，因此，新疆种群可能是从地中海地区传入中国的；由中国朱砂叶螨27个地理种群和国外红色型二斑叶螨6个种群所构建的系统发育树也将所有的序列划分为两个主要的分支，各分支中各地理种群之间的亲缘关系互不相同。二斑叶螨和朱砂叶螨各地理种群间的COI序列均有显著差异，经分析，我们认为导致这些地理种群之间亲缘关系互不相同的原因可能是由于一些生态和地理因素，比如寄主条件、气候条件、感染Wolbachia、地理隔离等。四、基于核糖体DNA-ITS2基因序列，对我国二斑叶螨和朱砂叶螨各地理种群进行系统发育分析 为了了解中国二斑叶螨和朱砂叶螨各地理种群间的系统发育关系，我们采用直接测序法对核糖体DNA中的ITS2区段序列进行测定和分析。应用通用(保守)引物，通过PCR对我国二斑叶螨13个地理种群和朱砂叶螨27个地理种群的rDNA内转录间隔区2(ITS2)进行扩增，最终从这些地理种群中都扩增出了645bp左右的ITS2片段。通过对这些ITS2序列的比较分析，我们发现：二斑叶螨13个地理种群的ITS2序列完全一致，这可能是因为二斑叶螨的ITS2区段原本多态性就很低导致的；朱砂叶螨ITS2序列中的G+C含量为35.66％～36.28％；所有朱砂叶螨地理种群的序列共有12处不同，其中5个颠换、6个转换和1个2bp的插入／缺失，多态性位点的数量明显少于COI，这也证明了ITS2的多态性比COI低。从系统发育树我们可以看出：中国的二斑叶螨与日本的二斑叶螨亲缘关系较近，被分在同一支上，而与欧洲及美洲的11个种群亲缘关系较远；中国朱砂叶螨27个地理种群被划分为两个主要的分化枝，同COI序列表现出的系统发育关系一致。 与ITS2序列相比，相同叶螨各地理种群之间的COI序列有较大差异，我们推断各地理种群的ITS2序列之所以比COI序列差异少可能是因为叶螨ITS2的多态性原本就比COI的多态性低。由于二斑叶螨ITS2序列完全一致，我们不能全面地了解中国二斑叶螨各地理种群之间的关系，所以为了能深入地探讨二斑叶螨种内的差异，我们需要重新选择其它分子标记。另外，经分析，导致朱砂叶螨各地理种群之间的ITS2序列有差异的原因可能是由于一些生态和地理因素，比如寄主条件、气候条件、感染Wolbachia、地理隔离等。 五、 我国二斑叶螨和朱砂叶螨在分子水平上的差异分析 二斑叶螨和朱砂叶螨是世界上重要的农业害螨，在过去的几十年里国内外学者对二者是否为同一种一直存在着很大的争议。为了在分子水平上揭示二斑叶螨和朱砂叶螨的差异，深入探讨二者的遗传进化关系，本文对我国二斑叶螨13个地理种群与朱砂叶螨27个地理种群的mtDNA-COI基因序列和rDNA-ITS2序列进行比较和分析，从构建的系统发育树中我们可以看出：在mtDNA-COI基因序列的系统发育树中，朱砂叶螨和二斑叶螨很难被区分开来；而在rDNA-ITS2序列的系统发育树中，所有的二斑叶螨被划分在同一分支中，并且同朱砂叶螨分隔开来。因此，我们推断朱砂叶螨和二斑叶螨可能不是同一个种。经分析，COI基因序列较适合于各地理种群间系统发育关系的分析，而ITS2序列则较适合于种间关系的分析。 综上所述，本研究通过比较mtDNA COI基因序列和核糖体DNA ITS2序列的差异，揭示了二斑叶螨和朱砂叶螨各地理种群之间的系统发育关系，这将有助于我们了解它们入侵途径和爆发机制，为有效地控制其扩散和危害奠定基础。最后还分析比较了二斑叶螨和朱砂叶螨二者之间在分子水平上的差异，首次在国内系统全面地从微观的分子生物学角度对二斑叶螨和朱砂叶螨是否为同一种进行深入探讨，这将有助于了解这两种叶螨的分类地位，为现在肯有极大争论的同种或异种学说提供科学依据。

目录

文摘

英文文摘

原创性声明及学位论文版权使用授权书

第一章 文献综述

第二章 中国二斑叶螨各地理种群分子遗传结构的研究

第三章 中国朱砂叶螨各地理种群分子遗传结构的研究

第四章 中国二斑叶螨和朱砂叶螨在分子水平上的差异研究

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的学术论文