长途运输应激猪组织损伤与hsps mRNA转录、HSPs表达相关性研究

摘要

应激是机体受到应激性刺激后所产生的一种非特异性反应，适当的应激对机体有利，但是过强或维持时间过长的应激可以造成组织和器官的病理性损伤，甚至导致动物猝死。运输应激每年为世界经济带来巨大损失，且目前国际上对运输应激没有统一的判定标准。应激时，组织细胞中的热休克蛋白(HSPs)的含量会发生急剧变化，维持细胞内环境平衡，帮助细胞耐过生物逆境。本试验将在相同环境中饲养的18头出栏育肥猪随机均分为A～F等6组，每组3 头。试验当日，对照组猪(A组)处于正常饲养环境，其他各试验组猪用动物运输车 辆务别进行1h(B组)、2h(C组)、4h(D组)、6h(E组)和10h(F组)的运输应激，路途运输模拟国内普通等级公路的运输状况(当时室外温度为18-25℃)，速度控制在50-60km．h<'-1>，整个运输过程没有饮水和喂食。对运输应激到试验设定时间的试验组猪进行及时剖杀，采取血液，分离血清用于肌酸激酶(CK)和谷草转氨酶(AST)的检测；采取心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、淋巴结等组织一份，固定于10％中性福尔马林溶液中，用于病理组织学观察和Hsp27、Hsp70以及Hsp90的免疫组织化学检测；同样两份组织样品用液氮速冻后，冻存于-70℃冰箱，用于hsp70mRNA和hsp90mRNA定位和定量检测，探讨长途运输应激猪组织损伤与hsps mRNA转录、HSPs表达之间的相关性。 利用组织学以及临床病理学等方法，研究长途运输应激对育肥出栏猪组织的应激性损伤。结果表明：长途运输应激初期(1～2h)，反映组织损伤的肌酸激酶(CK) 和谷草转氨酶(AST)在血液中的含量都显著升高(P＜O.05)；运输应激4h时，CK 及AST活性有所下降，和对照组相比差异不显著(P＞0.05)；而当运输应激持续到6h 和10h时，CK和AST活性又显著升高。组织学观察，在长途运输应激初期(1～2 h)， 所检组织均出现毛细血管扩张充血、细胞急性肿胀等急性病理性损伤变化,损伤程度 较为严重；运输应激4h时，各组织的病理损伤与应激初期相似，但血管的充血程度 有所减轻；运输应激持续到6～10 h时，各组织尤其心肌纤维的损伤程度进一步加剧。 长途运输应激可以导致组织细胞应激性损伤，并且组织的损伤程度随着应激时间的延长有所波动。 利用免疫组织化学方法，研究HsPs在长途运输应激育肥猪组织细胞中的分布。结果显示，Hsp70、Hsp90以及Hsp27在组织细胞中的定位无肉眼可见的随着应激时间的延长而发生的相应变化，但是不同的HSPs在组织细胞中的分布有较大差异。Hsp70在肺脏细支气管粘膜层、心肌纤维胞浆、肝细胞的胞浆和胞核、淋巴结和脾脏的血管壁、背最长肌纤维的胞浆和部分胞核以及肾小管上皮细胞的胞浆和部分胞核中均有强阳性着色；Hsp90在肺脏细支气管粘膜层、心肌纤维和肝细胞的胞浆、淋巴结和脾脏中的血管壁以及部分淋巴细胞、背最长肌纤维的胞浆和部分胞核以及部分肾小管上皮细胞的胞浆中高表达；Hsp27在肺脏细支气管的粘膜下层、心肌纤维和肝细胞胞浆、背最长肌纤维的胞浆和胞核以及受检组织的血管壁及内皮细胞中呈强阳性表达。 根据hsp70和hsp90 mRNA的基因序列，设计并合成引物，将PCR扩增的基因片段克隆到pGEM-T载体，重组质粒经筛选、鉴定，利用体外转录系统，制作RNA探针，建立检测lasps mRNA的原位杂交方法。利用自建的原位杂交方法，对lasp70 mRNA、hs090 mRNA进行组织细胞定位，探讨hsps mRNA组织细胞定位与HSPs组织细胞定位以及运输应激造成的组织损伤之间的相关性。结果显示：hsp70 mRNA和hsp90mRNA广泛分布于各组织细胞中，尤其在细胞核中相对集中，在肾小管上皮细胞胞浆中也呈强阳性着色。 根据hsp70、hsp90和GAPDH mRNA的基因序列，设计并合成引物，将PCR扩增的基因片段克隆到pGEM-T载体，重组质粒经筛选、鉴定，体外转录出RNA，梯度稀释作为阳性标准品，用于标准曲线的制定和样品检测，建立了一步法实时荧光定量RT-PCR技术平台，并对其有效率、敏感性、特异性进行了检测。结果证明，我们建立的一步法实时荧光定量RT-PCR技术平台可以真实的反映反应管中模板的数量，可以用于mRNA水平的检测。利用自建的猪hsps mRNA荧光定量RT-PCR技术平台，对长途运输猪各组织中hsp70和hsp90 mRNA转录水平进行检测，探讨长途运输应激猪组织损伤与各组织中hsps mRNA转录水平的相关性，为hsps mRNA作为机体应激的生物标识提供试验数据。经1、2、4、6和10 h的运输应激后，所检组织中hsp70mRNA的转录水平随着运输应激时间的延长呈现出上升的趋势，运输应激到10 h时，hsp70 mRNA的转录水平在肝脏、心脏、肺脏、淋巴结、肾脏和背最长肌组织中分别为对照组的2.5、4.1、23、9.6、14.2和5.1倍；hsp90 mRNA在不同组织中随着运输应激时间的延长其变化趋势波动较大。运输应激可以影响hsps mRNA转录水平的变化，并且对不同家族的hsps mRNA转录水平的影响不同。hsp70 mRNA的转录水平随着运输应激时间的延长一直上升，可作为猪运输应激的生物标识之一。 准确称量组织样品，进行组织研磨、匀浆、低温离心，SDS-PAGE电泳，利用单 克隆抗体建立间接法HSPs Western blotting检测方法；并通过组织匀浆液点硝酸纤维素膜，建立间接法HSPs Dot blotting检测方法，并对两种方法进行了比较。Westernblotting检测方法可以通过SDS-PAGE电泳将蛋白质按分子量分开，通过单抗识别、灰度分析，对特种蛋白质进行准确定量，但是需要进行SDS-PAGE电泳和转印，步骤繁琐，耗时较长；而Dot blotting检测方法可以将组织样品匀浆液直接点膜，方法简单、省时，且大量样品可以在同一张膜上进行检测，结果可靠。不过不能排除非特异性结果的干扰。

目录

文摘

英文文摘

前言

论文说明：符号及缩略语

原创性声明及学位论文版权使用授权书

第一篇文献综述 第一章热休克蛋白（HSPs）研究进展

第二篇试验研究 第二章长途运输应激对猪组织的应激性损伤

第二篇试验研究 第三章HSPs在长途运输猪组织细胞中的分布

第二篇试验研究 第四章原位杂交法检测hsp70 mRNA和hsp90 mRNA在运输应激猪组织细胞中的分布

第二篇试验研究 第五章运输应激猪hsps mRNA转录水平荧光定量RT-PCR方法的建立

第二篇试验研究 第六章长途运输应激对猪组织细胞中hsp mRNA转录水平的影响

第二篇试验研究 第七章运输应激猪HSPs定量方法探讨

第二篇参考文献

附录

全文总结

致谢

论文发表情况