棉疫病菌诱导非寄主过敏反应激发子基因的克隆及功能研究

摘要

本文利用PVX病毒载体建立棉疫病菌(Phytophthora boehmeriae)的cDNA文库，采用功能筛选策略克隆了能诱导烟草产生过敏反应的激发子基因(片段)。以农杆菌Mogl01为宿主、利用PVX病毒表达载体构建了含有6800个单克隆的棉疫病菌cDNA，采用牙签接种本氏烟(Nicotiana benthamiana)，从4100个克隆中筛选到12个能引起烟草过敏反应的阳性克隆。对上述阳性克隆进行序列测定和分析，发现其中7个与已知的基因具有较高的同源性，其中克隆PBC413编码一个特异的elicitin蛋白；克隆PBCl63编码一个Rab蛋白，与大豆疫霉的RAB基因同源性较高；克隆PBC241编码prohibitin蛋白；PBN62编码一个热激蛋白60(HSP60)。还有5个克隆在公共数据库中没有同源基因，提示可能是该病原茵特异的激发子基因。上述结果表明，利用病毒表达载体建立cDNA文库采用功能筛选策略可从棉疫病菌全基因组范围内筛选诱导烟草产生HR的激、发子基因，该方法可望为其它植物病原菌激发子基因的克隆提供技术平台。从棉疫病菌(Phytophthora boehmeriae)cDNA文库中筛选到一个能引起烟草过敏反应的elicitin基因，命名为Pbelicitin（Phytophthora boehmeriae elicltin)。经SOUthem杂交分析表明，该基因在基因组中至少有5个拷贝。该基因的原核表达产物能诱导野生型烟草Xanthi和不能积累乙烯的Tetre烟草产生过敏反应和对TMV与Phytophthora　nicotianae产生系统获得抗性，且能诱导这两种烟草的PR-1α、PR-1b和PR-1c基因的表达，表明Pbelicitin诱导的HR和SAR受不依赖于乙烯的信号途径控制；而该原核融合表达产物只能诱导不能积累水杨酸的转nahG基因烟草NahG产生过敏反应，不能诱导其PR-1α、PR-1b和PR-1c的表达，表明SA不参与该elicitin诱导的HR，而参与其诱导的系统获得抗病性。并且在棉疫病菌与棉花亲和互作中Pbelicitin下调表达的。从棉疫病菌(Phytophthora boehmeriae)cDNA文库中筛选到一个能引起烟草过敏反应的RAB基因片段，根据公共数据库序列比对后，根据同源序列设计引物，扩增出了该基因的长度为606bp的全长序列，命名为PbRAB。经southem杂交分析表明，该基因在基因组中是单拷贝的。PbRAB基因的原核表达产物处理野生型烟草Xanthi后，发现能够作为效应因子引起烟草的。HR反应和H<,2>O<,2>的积累，通过RT-PCR分析表明经处理的烟草在过敏性坏死反应过程中有PR基因的诱导表达。本试验还构建了四个功能突变体，初步分析了引起过敏性坏死反应的功能区域，并确认了基因原核表达产物发挥功能与其第一个跨膜结构域(15.20位氨基酸)有关。本文还就棉疫病菌(Phytophthora boehmeriae)分泌的蛋白激发子PB90诱发不结球白 菜产生的H<,2>O<,2>在其诱发该植物过敏性细胞死亡和防卫反应中作用机制进行了研究。首先 建立了激发子PB90与不结球白菜新的植物．激发子互作系统，该激发子引起的细胞死亡与 哺乳动物的细胞凋亡具有相似的形态学特征，如细胞膜皱缩、细胞核浓缩，表明该激发 子诱导不结球白菜细胞死亡是一个细胞凋亡过程。不结球白菜叶片经激发子PB90处理后 能迅速提高体内苯基丙氨酸解氨酶PAL的活性，同时诱导PR-l和Chistinase的增强表达， 且能够诱导不结球白菜对炭疽病菌(Colletotrichum higginsianum)和大白菜软腐病菌 (Erwinia carotovora var．carotovora)等病原菌产生抗性。不结球白菜叶片经激发子PB90注 射处理大约3 h后出现H<,2>O<,2>的积累，而激发子处理引起的细胞死亡在12 h出现。在激发子 处理前30 rain先注射抗氧化剂(DTT，glutathione和ascorbic acid)和DPI(NADPH氧化酶抑制 剂)，能显著抑制PB90引起的细胞死亡和PR-I与Chitinase的表达。提示在不结球白菜中 PB90诱导的H<,2>O<,2>进发触发了细胞死亡和防卫反应，同时也表明激发子PB90诱导H<,2>O<,2>进发 介导该激发子诱发不结球白菜的细胞死亡和防卫反应。

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引言

上篇文献综述：第一章植物对病原菌的非寄主抗性

上篇文献综述：第二章植物病原菌激发子及其和植物互作机制研究

下篇研究内容：第一章棉疫病诱导非寄主过敏反应激发子基因的克隆

下篇研究内容：第二章棉疫病菌elicitin基因功能研究

下篇研究内容：第三章棉疫病菌RAB基因功能研究

下篇研究内容：第四章H2O2介导PB90诱导的不结球白菜细胞死亡和防卫反应

博士期间发表的论文

致谢