棉铃虫田间种群Cry1Ac抗性基因频率的估算及钙粘蛋白基因突变的鉴定

摘要

棉铃虫Helicoverpa armigera(Habner)是为害棉花的一种重要世界性害虫。20世纪90年代初，由于棉铃虫对化学杀虫剂产生严重抗性而导致其在我国北方棉区连年大爆发。Bt抗虫棉由于其良好的杀虫效果被广泛种植，持续、大面积应用Bt抗虫棉将对靶标害虫形成强大的选择压力，靶标害虫的潜在抗性风险将成为Bt抗虫棉使用寿命的限制性因子。调查田间棉铃虫对Bt抗虫棉的敏感性水平，检测田间低水平的抗性基因频率，将为抗性治理策略的制订和实施提供可靠依据。以DNA为基础的抗性基因分子检测方法将大大提高田间抗性检测的效率，但是此方法需要深入了解Bt抗性竹分子机制。本文对2004年、2005年华北地区棉铃虫田间种群对CrylAc的抗性基因频率进行了估算，鉴定了田间棉铃虫钙粘蛋白基因突变的类型，从而为建立DNA为基础的抗性分子检测方法提供了重要基础。 1．不同地区棉铃虫田间种群对CrylAc活化毒蛋白的敏感性差异用毒蛋白涂表法测定了2004年、2005年采自河南安阳、河北高阳、河北沧县、新疆阿克苏和新疆沙湾棉铃虫田间种群对CrylAc活化毒蛋白的敏感性水平，结果表明华北棉区与新疆内陆棉区棉铃虫种群对CrylAc的敏感性存在一定的地区性差异(<8倍)。我国华北地区棉铃虫田间种群对CrylAc还没有产生明显的抗性。 2．棉铃虫田间种群对CrylAc抗性等位基因频率的估算采用改进的F<,1>筛查法检测了2004年、2005年采自华北地区的棉铃虫田问种群对Bt毒蛋白CrylAc的抗性基因频率。2004年从河南安阳、2005年从河南安阳和河北沧县Bt抗虫棉上采集二代棉铃虫卵，在室内用人工饲料饲养至2龄幼虫，用CrylAc活化毒蛋白(1μg/cm<'2>)进行初筛，将初筛存活成虫与室内筛选的GYBT抗性品系成虫进行单对杂交，并用区分剂量(2.5gg/cm<'2>)对F<,1>代二龄幼虫进行检测。经检测和估算，2004年河南安阳田间种群的抗性基因频率为5.6x10<'-3>；2005年河南安阳棉铃虫种群和河北沧县棉铃虫种群对CrylAc抗性基因频率基本一致，分别为1.4×10<'-3>和1.5×10<'-3>。 3．田间棉铃虫钙粘蛋白基因突变的鉴定通过F<,1>筛查，有7个单对系F<,1>代抗性个体(田间个体×室内抗性个体)可能携带一对与抗性相关的钙粘蛋白等位基因，一条来自抗性品系亲本(rl，GenBank登录号为AY647975，已经证明其发生了缺失突变)，另一条来自田间亲本。采用RT-PCR及3'-RACE技术，分别克隆了这7个单对系F<,1>代抗性个体中来自田间亲本的钙粘蛋白基因全长cDNA，发现了2个新的钙粘蛋白基因突变型。通过与敏感品系钙粘蛋白氨基酸序列(Ha_BrR，GenBank登录号为AY647974)的比对，发现其中一个基因突变型(r2)在翻译区1113位碱基变异产生了一个提前的终止密码子TGA，从而导致表达的受体蛋白被严重截短，仅有371个氨基酸。另一个基因突变型(r3)在钙粘蛋白基因的重复区域EC1和EC3之间缺失了507个碱基，导致169个氨基酸的缺失。本研究发现了田间棉铃虫钙粘蛋白基因突变的新类型，对于建立基于DNA的抗性基因分子检测技术提供了重要依据。

目录

文摘

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第一章文献综述

第二章棉铃虫田间种群Cry1Ac抗性基因频率的估算

1材料和方法

2结果与分析

3讨论

第三章棉铃虫田间种群钙粘蛋白基因突变的鉴定

1、材料与方法

2结果和分析

3讨论

全文总结

参考文献

致谢

附录：发表学术论文