农杆菌介导遗传转化获得转β-甘露糖苷酶正义、反义基因的棉花

摘要

棉纤维是纺织工业的重要原料，在国民经济中占有重要地位。因此，从分子水平阐明棉纤维发育的机理，具有重要的理论价值和现实意义。 为了研究β-甘露糖苷酶(GhManA2)在棉纤维发育中的确切功能，．本研究将其基因序列以正向，反向构建到由纤维特异启动子E6驱动的植物表达载体pBll21中，通过农杆菌介导法将其转入棉花，试图通过该基因在纤维发育中的过量表达和抑制表达对棉纤维发育的影响来研究其在纤维发育中的确切功能。本研究包括以下2个方面： 利用DNA重组技术将基因GhManA2序列以正向，反向构建到由纤维特异启动子E6驱动的植物表达载体pBI121-E6中，经过SmaI，NotI酶切鉴定和特异引物的PCR扩增及测序证明载体构建成功，可用于棉花的遗传转化。分别以泗棉3号和W0品系为基因转化受体，将正义、反义GhManA2载体利用农杆菌介导法转化棉花，共得到53个愈伤系的500株转化的再生植株。 用NPTⅡ和启动子．目的基因引物对再生植株DNA进行PCR扩增，初步得到T<,0>代转化的阳性植株230株。正义载体的再生植株中，NPTⅡ基因引物阳性率为97.92％，启动子．目的基因引物的阳性率为87.23％，反义载体的再生植株中，NPTⅡ基因引物阳性率为95.19％，启动子-目的基因引物的阳性率为64.65％。只有用NPTⅡ基因引物和启动子-目的基因引物扩增结果都为阳性的植株才被初步认为是阳性植株。本实验中，一共嫁接了230株阳性植株，成活了196株。随机取T<,0>代8株PCR 阳性再生植株做Southern杂交。结果证明NPTⅡ基因已经整合到植物基因组中。进一步以E6届动子为探针进行Southern杂交，有部分植株有特异的杂交信号说明T-DNA区的E6启动子已整合到棉花基因组中。对T<,1>、T<,2>代转基因植株提取叶片DNA，用启动子-基因特异引物对其进行PCR 扩增，在检测的7个T<,1>转基因株系中，目的基因的分离比例都符合孟德尔一对基因的分离比例(3：1)，结合Southern杂交结果，推测多拷贝插入的目的基因可能整合到了同一条染色体上。

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第一部分文献综述

引言

一、棉纤维发育相关基因研究进展

1纤维分化相关基因

2纤维伸长相关基因

3纤维细胞次生壁合成相关基因

4纤维成熟相关基因

二、β-甘露糖苷酶基因研究进展

三、反义RNA技术研究进展

1反义RNA的概念及其发现

2反义RNA的作用原理

3反义RNA技术在植物基因工程中的应用

四、植物转基因技术研究进展

1载体转移法

2无载体转化法

3棉花基因转化研究进展

五、本研究的目的、意义

第二部分研究报告

引言

1材料与方法

1.1实验材料

1.2本研究的技术路线

1.3植物表达载体的构建

1.4农杆菌介导的棉花遗传转化

1.5转基因植株的分子检测

2结果与分析

2.1植物表达载体的构建

2.2农杆菌介导的棉花遗传转化

2.3转基因植株的分子检测

2.4 T0代转基因棉花纤维与受体纤维的比较

2.5部分转基因株系T0，T1，T2比较

2.6转基因植株的遗传分析

3讨论

3.1植物表达载体的构建

3.2农杆菌介导的棉花遗传转化

3.3转基因植株的分子检测

3.4下一步工作设想

全文结论

参考文献

致谢