甜菜夜蛾和斜纹夜蛾性信息素感受相关蛋白的分子克隆、定量分析及原核表达

摘要

昆虫在长期进化过程中形成了高度灵敏的嗅觉系统，并以此来感受自然环境中的各种化学信息，产生相应的生理和行为反应，如寻找配偶、食物源和栖息场所、产卵行为、逃避危险或者不适合的栖息地和寄主等，因此嗅觉系统对于昆虫的生命活动至关重要。将昆虫嗅觉应用于害虫防治，已成为害虫管理的一个重要手段，并将在未来害虫治理中起到越来越重要的作用。甜菜夜蛾和斜纹夜蛾是世界性分布的重要农业害虫，危害很多种粮食和蔬菜作物，生产上主要依靠化学防治，但由于害虫抗药性以及蔬菜等作物的无公害防治要求，迫切需要寻求新的防治技术。这两种夜蛾雌虫性信息素组分已得到鉴定，并成功用于田间种群的预测预报，但将性信息素直接用于害虫的大量诱杀或交配干扰，防治效果并不理想。因此，深入研究蛾类昆虫性信息素通讯的分子机制，弄清性信息素感受相关蛋白及其功能，必将有助于针对特定嗅觉蛋白设计和开发更为高效的两性通讯的调控技术，服务于蔬菜和粮食的无公害生产。本文对甜菜夜蛾和斜纹夜蛾性信息素感受相关蛋白进行了研究，主要结果如下： 1.甜菜夜蛾信息素结合蛋白基因的克隆和序列分析 通过比较几种已发表夜蛾科昆虫的信息素结合蛋白(PBPs)氨基酸序列，设计合成一对简并性引物，利用反转录多聚酶链式反应(RT-PCR)技术从甜菜夜蛾雄虫触角扩增得到2个分别为275bp和281bp的cDNA片段SexigPBP1和SexigPBP2。随后，利用cDNA末端快速扩增(RACE)技术进行两个cDNA全序列克隆，SexigPBP1cDNA全序列为1，077bp，SexigPBP2为819bp。S. exigua的2个PBP基因推导的氨基酸序列与己知其它鳞翅目昆虫PBP具有较高的同源性，但彼此间的同源性为44％。 以基因组DNA为模板进行扩增后，发现S. exigua的2个PBP基因具有相同的intron/extron结构，各含有2个内含子，并且内含子具有典型的GT-AG结构。SexigPBPJ在Glu45和Leu46之间插入一个87 bp的内含子；在Asp105内插入第二个内含子，长142bp。SexigPBP2在Glu49和Met50之间插入一个295 bp的内含子；在Asp110内插入第二个内含子，长644bp。 RT-PCR结果表明SexigPBP1和SexigPBP2在雌雄虫触角内均有表达，但在其他组织中不表达。进一步用实时定量PCR技术比较了雌雄蛾触角内两个PBP基因的表达水平，结果发现，雌蛾触角内的SexigPBP1和SexigPBP2的表达水平仅为雄蛾的39％和73％。 2.斜纹夜蛾信息素结合蛋白基因的克隆和序列分析 利用RT-PCR和RACE技术，从斜纹夜蛾雄蛾触角扩增得到2个信息素结合蛋白(PBPs)cDNA全序列：SlitPBP1和SlitPBP2。SlitPBP1全序列为1，085 bp，编码164个氨基酸，N-端头23个氨基酸为预测的信号肽，其后的成熟蛋白由141个氨基酸组成，预测分子量为16,285 Da，等电点为5.14。SlitPBP2全长804 bp，编码170个氨基酸，最初27个氨基酸为信号肽，143个氨基酸组成的成熟蛋白预测分子量为15,998 Da，等电点为4.92。2个PBP基因推导的氨基酸序列与已知其它鳞翅目昆虫PBP具有较高的同源性，两者彼此之间的同源性为45％。 SlitPBP1和SlitPBP2内各含有2个内含子，并且内含子具有典型的GT-AG结构。SlitPBP1在Glu45和Leu46之间插入一个76 bp的内含子；在Asp105内插入第二个内含子，长104 bp。SlitPBP2在Glu49租Met50之间插入一个437 bp的内含子；在Asp110内插入第二个内含子，长1，251 bp。可见，PBP2的内含子比PBP1长得多，同一个基因第二个内含子明显比第一个长。 RT-PCR结果表明SlitPBP1和Slit PBP2仅在雌雄虫触角内表达。进一步用实时定量PCR技术比较了雌雄虫触角内SlitPBP1和Slit PBP2的表达水平，结果发现，雌蛾触角内的SlitPBP1和SlitPBP2的表达水平仅为雄蛾的2.1％和7.0％。 搜集现已报道的鳞翅目昆虫PBP，利用Mega3.1软件进行系统进化分析，结果显示夜蛾科昆虫的PBP被清楚地分为三个组，本研究发现的SexigPBP1和SlitPBP1同属于第二组(Group2)，SexigPBP2和SlitPBP2同属于第三组(Group3)。 3 甜菜夜蛾信息素结合蛋白基因的原核表达及蛋白纯化 在成功克隆甜菜夜蛾2个PBP基因的基础上，将SexigPBP1和SexigPBP2构建到原核表达载体pET-30a(+)中，在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达，表达产物经SDS-PAGE检测，所表达的两个重组蛋白约22kD，主要以包涵体形式存在。超声波破碎离心后，用8M尿素对包涵体进行溶解，经镍离子亲和层析柱一步法纯化得到的PBP的纯度非常高，并且回收率也很高。为了避免N-端多余序列的干扰作用，利用肠激酶对已纯化的目的蛋白进行专一性酶解，酶解产物再经亲和层析纯化，得到已除去N-端标签的目的蛋白(约16kD)，为进一步研究PBP与性信息素组分之间的作用打下基础。利用常规免疫方法，用重折叠的目的蛋白SexigPBP1免疫Babl/c小鼠获得较高效价抗体，为进行下一步实验提供材料。 4 甜菜夜蛾和斜纹夜蛾嗅觉受体基因的克隆和序列分析 高度变异的昆虫嗅觉受体家族中有一类在不同目昆虫中非常保守的嗅觉受体，本文通过比对几种已发表昆虫的嗅觉受体(ORs)氨基酸序列，设计合成一对简并性引物，分别在甜菜夜蛾和斜纹夜蛾触角内克隆到292 bp和1，063bp的cDNA片段，命名为SexiOR2和SlitOR2。利用cDNA末端快速扩增(RACE)技术进行两个cDNA全序列克隆，SexiOR2全长为1，906 bp，阅读框架全长1，419 bp，编码473个氨基酸，预测分子量为53,303 Da，等电点为8.60。SlitOR2全长为2,483 bp，阅读框架全长1，419 bp，编码473个氨基酸，预测分子量为53,267 Da，等电点为8.63。SlitOR2的3’非编码区(937 bp)要比SexiOR2的(350 bp)长很多。经预测氨基酸序列中具有典型的G蛋白偶联受体(GPCR)的七个跨膜区域。SexiOR2和SlitOR2与已知其它昆虫嗅觉受体的同源性都在50％以上，并且两者之间的同源性高达98％。系统发育分析表明，已知的鳞翅目昆虫嗅觉受体蛋白独立形成一组。 本论文利用分子生物学技术，成功克隆出与甜菜夜蛾和斜纹夜蛾性信息素感受有关的两类蛋白，并进行了系统进化等相关分析。在此基础上，用原核表达系统表达并纯化了甜菜夜蛾的2个PBP，并制备了甜菜夜蛾PBP1的抗体。研究结果为弄清这两种夜蛾性信息素的感受机制打下了基础，并为研制和开发新型、高效的两性通讯阻断剂提供了依据。

目录

文摘

英文文摘

前言

论文说明：英文缩略语

声明

第一章文献综述

1嗅觉感器及触角感受机制

2昆虫信息素结合蛋白的研究进展

2.1昆虫信息素结合蛋白的分子特征

2.2信息素结合蛋白在触角中的分布

2.3昆虫信息素结合蛋白与信息素分子的结合与释放机制

2.4昆虫信息素结合蛋白的生理功能

2.5昆虫信息素结合蛋白的进化基因组学

3嗅觉受体的研究进展

3.1脊椎动物嗅觉受体的发现

3.2嗅觉受体蛋白的结构

3.3无脊椎动物嗅觉受体

第二章甜菜夜蛾2个信息素结合蛋白基因的克隆和相对表达水平研究

1材料与方法

1.1供试昆虫

1.2主要试剂和仪器设备

1.3昆虫核酸提取

1.4 cDNA第一链的合成

1.5 PCR引物设计

1.6 PCR扩增

1.7 RACE扩增PBP基因的cDNA

1.8 PCR产物纯化、克隆、测序和序列分析

1.9甜菜夜蛾PBP基因的定量分析

2结果与分析

2.1甜菜夜蛾PBP基因cDNA片段的克隆与分析

2.2甜菜夜蛾PBP基因全长cDNA的克隆与分析

2.3甜菜夜蛾PBP基因的组织特异性表达

2.4 PCR产物熔解曲线及荧光定量PCR扩增效率一致性分析

2.5甜菜夜蛾PBP基因相对表达量的比较

3讨论

第三章斜纹夜蛾2个信息素结合蛋白基因的克隆、序列分析及相对表达水平研究

1材料与方法

1.1供试材料

1.2主要试剂

1.3昆虫核酸提取

1.4 PCR引物设计

1.5 PCR扩增

1.6 RACE技术扩增PBP基因的cDNA全序列

1.7 PCR产物纯化、克隆和测序

1.8斜纹夜蛾PBP基因的定量分析

1.9 Western杂交分析

2结果与分析

2.1斜纹夜蛾PBP基因cDNA片段的克隆与分析

2.2斜纹夜蛾PBP基因全长cDNA的克隆与分析

2.3斜纹夜蛾PBP同源性比较及系统发育分析

2.4斜纹夜蛾PBP基因的组织特异性表达

2.5 PCR产物熔解曲线及荧光定量PCR扩增效率一致性分析

2.6斜纹夜蛾PBP基因相对表达量的比较

2.7 Western杂交结果

3讨论

第四章甜菜夜蛾信息素结合蛋白基因的原核表达及重组蛋白的纯化

1材料、试剂和仪器设备

1.1供试昆虫

1.2质粒和菌株

1.3主要化学试剂

1.4主要仪器设备

2实验方法

2.1引物设计及PCR产物鉴定

2.2重组表达质粒的构建

2.3连接产物的转化和鉴定

2.4重组质粒的诱导表达

2.5表达产物的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测

2.6信息素结合蛋白基因的表达和纯化

2.7融合蛋白的酶解

2.8蛋白质浓度测定

2.9抗体制备

2.10 Western杂交分析

3结果

3.1表达质粒的构建和鉴定

3.2重组质粒在大肠杆菌中表达及可溶性分析

3.3重组蛋白的纯化及肠激酶酶解

3.4 ELISA检测免疫动物的抗体水平

3.5 Western杂交结果

4讨论

第五章甜菜夜蛾和斜纹夜蛾嗅觉受体基因的克隆及序列分析

1材料与方法

1.1供试材料

1.2主要试剂

1.3总RNA的提取及cDNA第一链的合成

1.4 PCR引物设计

1.5 PCR扩增

1.6 RACE扩增PBP基因的cDNA全序列

1.7 PCR产物纯化、克隆、测序和序列分析

2结果与分析

2.1甜菜夜蛾和斜纹夜蛾嗅觉受体基因的克隆与分析

2.2嗅觉受体同源性比较及系统发育分析

3讨论

全文总结

参考文献

附录:攻读博士学位期间学术论文的发表情况

致谢