内共生菌Cardinium在中国叶螨地理种群中的分布和对叶螨的生殖调控作用

摘要

Cardinium是近年来在节肢动物体内发现的一种次生共生菌，已经报道Cardinium具有调控寄主生殖的功能，它能够引起雌性化，诱导产雌孤雌生殖，诱导胞质不融和等。单倍二倍体种群寄主和Cardinium间相互作用时，不亲和的杂交组合会导致受精卵部分至完全单倍体化；而对于产雄孤雌生殖的单倍二倍体，胚胎中父本基因组丢失或被消除后，该胚胎仍可以发育成为单倍体的雄虫。因此，在不亲和的组合中，受精卵或者发育成单倍体雄虫或者死亡，从而逐渐减弱后代的繁殖能力。朱砂叶螨Tetranychus cinnabarinus(Boisdlaval)和二斑叶螨T. urticae Koch是农林生产中十分重要的害螨，前者危害蔬菜、棉花等多种农作物，后者危害果树林木、温室栽培植物和花卉等，给农业生产造成大量损失。它们扩散迅速、世代周期短、发育进度快、繁殖能力强，尤其朱砂叶螨在中国的分布范围十分广泛，发生甚为严重。不合理的化学防治使其抗性在不断提高，所以寻求更有效的防治方法非常重要。节肢动物中的共生菌扰乱寄主生殖的发现，不仅促进了进化方面的研究，同时也为叶螨的生物防治提出了新的思路。 本文利用分子生物学方法，通过PCR扩增叶螨体内感染的Cardinium的16S rDNA基因序列片段，分别对采自中国不同地区的朱砂叶螨与二斑叶螨的感染情况作了检测，并对受感染种群中Cardinium的16S rDNA基因进行序列测定，根据GenBank上登录的一些相似度较高的节肢动物内共生菌建立系统发育树，确定我国叶螨感染的Cardinium的进化位置，同时分析了我国受感染地理种群间Cardinium的亲缘关系，揭示了Cardinium在各地理种群间水平传播的可能性，这有助于我们了解Cardinium的分类地位和在寄主中的分布特点；最后选取两个感染率较高的代表种群，培养不同感染类型的品系并从中挑取雌雄虫单独进行杂交实验，发现我国叶螨感染的Cardinium品系能够诱导寄主的胞质不亲和现象，初步了解了其在生殖调控方面的作用。 一、试验材料的采集和饲养 在全国范围内选择较有代表性的地区分别对朱砂叶螨和二斑叶螨进行采样，共采集了27个朱砂叶螨地理种群和13个二斑叶螨地理种群。实验室内采用隔水法在菜豆(Phaseolus vulgaris L．)叶片上进行恒温恒湿隔离饲养，饲养条件为25±1℃，L 16：共生菌Cardinium在中国叶螨地理种群中的分布和对叶螨生殖调控作用的研究D 8，相对湿度60％。 二、 PcR扩增Cardinium的16S rDNA基因序列片段，并分析比较我国叶螨各地理种群中Cardinfum的感染情况 根据Wleeks等(2003)设计的一对特异性引物，从每个地理种群中随机挑取40头雌成螨分别提取总DNA，使用PCR扩增Cardinium的16S rDNA基因片段，检测了我国朱砂叶螨27个地理种群和二斑叶螨13个地理种群的感染情况，最终从朱砂叶螨的6个地理种群中扩增出了长度约为450 bp的16S rDNA基因片段，而二斑叶螨所有地理种群中都没有扩增出目的基因片段。Cardinium在中国朱砂叶螨种群间的感染率只有22.2％(6/27)，相对于Wolbachia明显要低很多，说明Cardinium对寄主和环境条件的要求可能更高。感染Cardinium的朱砂叶螨种群在地理位置上均位于北纬30至36度之间，且包含于2个温度带中，即北亚热带和暖温带，说明这两个气候带的气候条件可能更适合Cardinium的生存和传播。Cardinium在6个种群内的感染率也各不相同，表现出不均匀的分布，但随着各种群在地理上的分布位置似乎有从南至北逐渐升高的趋势，可能是由一些生态和地理因素所造成，如寄主条件、气候条件和地理隔离等。 三、设计一段特异性引物扩增Cardinium的16S rDNA基因并测定序列，对各地理种群之间的序列进行比较 使用能扩增所有真细菌16S rEINA全长的通用引物27 F和1513 R时，会扩增出叶螨体内可能同时存在的Wolbachia的16s rDNA。为了排除其干扰，我们设计了一对特异性引物来单独扩增Cardinium共生菌的16s rDNA基因，测定了我国朱砂叶螨六个受感染地理种群的Cardinium的接近全长的16s rDNA基因序列片段。每个地理种群随机抽取3～5个样本进行序列测定，以它们的一致序列为准。测得的序列长度在1338 bp左右，将测得的序列输入GenBank(网站上并利用BLAST进行序列比对分析，发现它们和叶螨科的红色型二斑叶螨Tetranychus uricae(red form)，红叶螨Tetranychus pueraricola以及桑始叶螨Eotetranychus suginamensis的内共生菌相似度高达99 ％，和冬青小爪螨Oligomychus ilicis的内共生菌相似度达98％。利用GenDoc软件，对测定的序列进行同源性比较后发现，安徽安庆和甘肃兰州种群的序列完全一致，其他种群相比之下仅有少数位点发生了碱基的变异，差异不大，这有可能说明这些种群感染的是同一个品系的Cardinium。 四、基于细菌的16S rDNA基因序列，对我国叶螨感染的和国外报道的 Cardinium进行系统发育分析 为确定我国朱砂叶螨体内的共生菌在Bacteroidetes菌门中的进化位置，我们将测得的序列登录到NCBI网站，并利用“BLAST”工具对测定的序列进行分析、DNA序列检索；用BioEdit软件进行序列编辑；用Clustal X软件进行序列比对(alignment)；比对结果输入MEGA2.1软件，采用距离法计算各样品间的遗传距离，并基于Kimura-2Parameter模型，用邻接法(Neighbor-Joining，NJ)构建系统发育树，通过自展1000次检验获得系统树分支的置信度。 从系统发育树中我们发现：我国朱砂叶螨感染的Cardinium和国外报道的属于叶螨科的内共生菌的序列形成了一个单独的分支，置信度达到99％，而和细须螨科短须螨属的Brevipalpus phoenicis，B．californicus和B．lewisi体内的Cardinium亲缘关系较远，而它们与Ixodes和Encarsia属寄生蜂感染的共生茵亲缘关系更近。同时，我国朱砂叶螨6个地理种群感染的内共生菌之间的亲缘关系极为相近。 五、 以两个感染的地理种群为代表，筛选100％单独感染和处理后完全不感染的品系，进行不同品系间的种内杂交实验，确定Cardinium对叶螨的生殖调控作用 为了了解Cardinium对我国朱砂叶螨的生殖调控作用，我们从检测到感染Cardinium的种群中选取山西运城和甘肃兰州两个感染率较高的种群作为代表，对Cardinium在有关寄主生殖调控方面的作用进行研究。通过人工培养100％感染Cardinium的种群和100％不感染的种群，并从中挑取不同感染类型的雌雄虫单独进行杂交实验。结果发现，抗生素处理后不感染的雌虫和受感染雄虫的交配表现出了单向的胞质不融和，而且两个种群表现出了两种CI类型：在山西种群不亲和的组合中，CI表现为卵孵化率显著降低，多数雌虫都产生出F<,1>雌虫后代，但是F<,1>代雌虫数量相对于其它三种组合明显减少；而在甘肃种群不亲和的组合中则表现为卵全部孵化且幼虫100％存活，但全部为雄虫后代。两个种群中Cardinium的亲缘关系非常相近，而它们却能够在不同的地理种群中表现出不同的CI表型，可能说明亲缘关系非常接近的品系也可以产生不同的表型。 综上所述，本研究利用分子生物学技术，从分子水平上调查了Cardinium在中国叶螨地理种群中的感染情况，并与Wolbachia的分布进行了比较，确定了我国叶螨体内Cardinium的进化位置，最后，通过不同感染类型组合的杂交实验证明了Cardinium对朱砂叶螨在生殖调控方面的影响，首次在国内较为系统全面地从微观和宏观角度对Cardinium进行了研究，这将为今后对Cardinium的感染机制和生殖调控作用的深入研究。 内共生菌Cardinium在中国叶螨地理种群中的分布和对叶螨生殖调控作用的研究究奠定基础，为共生菌在生物防治上的应用提供科学依据。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章文献综述

1 Bacteroidetes拟杆菌门内共生菌

1.1 Bacteroidetes的分类地位

1.2 Bacteroidetes在节肢动物中的分布

1.3 Bacteroidetes的传播方式

2 Bacteroidetes共生体系统的多样性

3 Bacteroidetes中的次生共生菌：生殖的调控者

3.1次生共生菌的生殖调控方式

3.2关于杀雄

4 Cardinium的研究进展

4.1 Cardinium的形态学和系统发育

4.2 Cardinium在节肢动物中的分布

4.3 Cardinium对寄主的调控作用

4.4Cardinium vs.Wolbachia

5次生共生菌的生殖调控作用与生物防治

5.1共生菌诱导的CI在生物防治上的应用

5.2共生菌诱导的PI在生物防治上的应用

6展望

7农业害螨的危害与防治进展

7.1朱砂叶螨和二斑叶螨在我国的发生与危害

7.2农业害螨的防治问题

第二章Cardinium在中国叶螨地理种群中的感染和分布情况的调查

第一节Cardinium在中国朱砂叶螨地理种群中的分布情况

1材料与方法

2结果

3讨论

第二节Cardinium在中国二斑叶螨地理种群中的分布情况

1材料与方法

2结果

3讨论

第三章我国朱砂叶螨体内Cardinium的16S rDNA基因片段的扩增和系统发育分析

1材料与方法

1.1供试材料

1.2朱砂叶螨总DNA的提取

1.3 PCR扩增体系和条件

1.4扩增产物的电泳检测

1.5 PCR产物纯化

1.6连接反应和转化

1.7序列测定

1.8序列分析

2结果

2.1朱砂叶螨体内Cardinium的16S rDNA基因序列

2.2系统发育分析

3 讨论

第四章Cardinium对我国朱砂叶螨的生殖调控作用

1材料与方法

1.1供试材料

1.2检测种群双重感染的情况

1.3筛选品系

1.4种群内遗传杂交实验

1.5数据整理和分析

2结果

2.1 双重感染的检测和种群筛选的情况

2.2 Cardinium对朱砂叶螨生殖的影响

3讨论

全文总结

参考文献

致谢

附录攻读硕士学位期间发表的学术论文