共生菌Wolbachia和Cardinium对中国截形叶螨和皮氏叶螨生殖调控作用的研究

摘要

截形叶螨Tetranychus truncatus Ehara和皮氏叶螨Tetranychus piercei McGregor属于蛛形纲Arachnida、蜱螨亚纲Acari、真螨目Acariformes、叶螨科Tetranychidae，是农林生产中十分重要的害螨。Wolbachia和Cardinium是广泛存在于节肢动物体内的两种共生细菌，均可通过寄主卵的细胞质进行母系遗传，并能通过调控寄主的生殖以实现在宿主种群中的稳定存在和扩散.在Wolbachia和Cardinium对其寄主的生殖调控中，诱导胞质不亲和是最普遍的方式。影响胞质不亲和表达的因素有很多，本文以皮氏叶螨和截形叶螨为实验材料，研究Wolbachia和Cardinium分别以及共同对其寄主生殖的调控，并深入探讨寄主的遗传背景、共生菌的株系、共生菌的密度以及共生菌在寄主生殖组织的分布对胞质不亲和表达的影响。此外，我们还通过荧光原位杂交技术，探究了Wolbachia和Cardinium的垂直传播模式:在卵的不同发育阶段，Wolbachia和Cardinium主要伴随着营养物质从滋养细胞、中肠、输卵管进入发育中的卵。
　　 Wolbachia和Cardinium均是能够诱导胞质不亲和的寄生菌。虽然Wolbachia和Cardinium感染同一寄主在自然界比较常见，但是对它们分别以及共同对寄主生殖影响的研究却很少。本研究以截形叶螨甘肃兰州(GS)种群，皮氏叶螨广东广州(GD)和云南玉龙(YN)种群为实验材料，对各种感染情况进行杂交组合试验，研究Wolbachia和Cardinium分别以及共同对我国截形叶螨和皮氏叶螨生殖和适合度的影响，并探索Wolbachia和Cardinium是否会影响彼此对CI的修饰和营救。研究发现在截形叶螨甘肃兰州(GS)种群和皮氏叶螨广东广州(GD)种群中单感染Wolbachia都诱导较弱的CI，单感染Cardinium和双感染品系均能诱导较强的CI，但是Wolbachia和Cardinium是否会影响彼此对CI的修饰和营救。而在皮氏叶螨云南玉龙(YN)种群中，Wolbachia诱导中等强度的CI，单感染Cardinium诱导较强的CI，但是在双感染品系中Wolbachia能够增强Cardinium诱导CI的能力。
　　 为了研究寄主的遗传背景和共生菌的株系对胞质不亲和表达的影响，对截形叶螨甘肃兰州(GS)种群、皮氏叶螨广东广州(GD)和云南玉龙（YN）种群感染的Wolbachia的wsp基因以及Cardinium的16S rDNA基因进行测定，结果显示甘肃兰州(GS)和广东广州(GD)两个地理种群的Wolbachia都属于的B组的Con亚群，云南玉龙种群感染的Wolbachia属于B组的Ori亚群，三个地理种群的Cardinium的相似度在97％-99％之间。结合杂交结果发现，截形叶螨甘肃兰州种群和皮氏叶螨广东广州种群虽然感染同一种株系的Wolbachia，感染的Cardinium也很相似，但是Wolbachia和Cardinium分别以及共同诱导的CI水平却不相同，可能是由于寄主的遗传背景的影响。另外，在皮氏叶螨云南玉龙种群中，Wolbachia同时存在于雌雄虫中显著提高了双感染雄虫诱导CI的水平，说明云南玉龙种群感染的Wolbachia可能是一种能够增强Cardinium诱导CI的能力的株系。
　　 为了研究共生菌的密度对胞质不亲和表达的影响，本研究通过荧光定量PCR技术，检测皮氏叶螨广东广州乖云南玉龙种群单感染和双感染的雄虫随着虫龄的增加Wolbachia和Cardinium的密度变化情况。结果表明，在广东广州种群内，随着虫龄的增加，双感染品系内的Wolbachia和Cardinium之间既有促进也有抑制，单感染品系和双感染品系内菌量变化趋势大致相同。在云南玉龙种群内，在雄螨羽化5天以后，Cardinium对Wolbachia的密度没有影响，但是Wolbachia促进了Cardinium的繁殖。雄虫体内Wolbachia和Cardinium密度的变化可能会对它们诱导CI产生重要影响。
　　 为了研究共生菌在寄主生殖组织的分布对胞质不亲和表达的影响，本研究将皮氏叶螨广东广州和云南玉龙种群单感染和双感染的雄螨制作切片，并通过荧光原位杂交技术检测雄螨的生殖组织内Wolbachia和Cardinium的分布情况。结果表明，Wolbachia和Cardinium分别以及共同诱导CI的水平与雄虫精子形成过程中的感染情况有关。共生菌诱导的CI水平与雄螨睾丸的精原干细胞区和睾丸外鞘中分布明情况呈正相关。此外，本研究将皮氏叶螨广东广州群双感染的雌螨制作切片，通过荧光原位杂交技术检测雌螨体内Wolbachia和Cardinium的分布情况，并根据叶螨卵发育的过程，我们推测出在皮氏叶中Wolbachia和Cardinium垂直传染的模式:1）在卵黄形成之前，共生菌伴随含有营养物质的细胞质从滋养细胞进入卵母细胞;2）在卵黄累积的过程中，在卵母细胞从中肠和血淋巴吸收营养物质过程中，共生菌随着营养物质一同进入卵母细胞;3）在卵进入腔和输卵管的过程中，卵壳逐渐形成，形成卵壳的原料来源于腔和输卵管的分泌物，在卵壳形成的过程中，共生菌也可能会伴随着这些分泌物进入卵。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1 Wolbachia的研究进展

1．1 Wolbachia的形态与分布

1．2 Wolbachia的系统发育

1．3 Wolbachia的传播规律

1．4 Wolbachia对寄主生殖活动的调控

2 Cardinium的研究进展

2．1 Cardinium的形态与分布

2．2 Cardinium的系统发育

2．3 Cardinium的传播规律

2．4 Cardinium对寄主生殖的调控

3 Wolbachia与Cardinium共同感染

3．1 Wolbachia与Cardinium共同对寄主的生殖调控

3．2 影响Wolbachia和lCardinium诱导的CI表达的因子

4．实时荧光定量PCR技术及其在共生菌研究领域的应用

4．1 实时荧光定量PCR原理

4．2 实时荧光定量PCR的应用方法

4．3 实时荧光定量PCR技术在共生菌研究领域的应用

5．荧光原位杂交

5．1 荧光原位杂交原理

5．2 荧光原位杂交技术的特点

5．3 荧光原位杂交技术的应用

第二章 Wolbachia和Cardinium分别以及共同对截形叶螨和皮氏叶螨生殖的影响

1 材料与方法

1．1 供试材料

1．2 叶螨总DNA的提取

1．3 PCR检测

1．4 品系筛选

1．5 杂交实验

2 结果

2．1 品系筛选

2．2 单独感染Wolbachia对叶螨生殖的影响

2．3 单独感染Cardinium对叶螨生殖的影响

2．4 Wolbachia与Cardinium共同对叶螨生殖的影响

2．5 Cardinium与Wolbachia彼此间对操纵寄主生殖能力的影响

2．6 Wolbachia和Cardinium分别以及共同对叶螨产卵量的影响

3 讨论

第三章 Wolbachia和Cardinium株系及寄主遗传背景对CI的影响

1 材料与方法

1．1 PCR扩增

1．2 PCR产物纯化

1．3 连接反应

1．4 转化反应

1．5 涂平板

1．6 接种

1．7 检测

2 结果

2．1 叶螨中细菌检测

2．2 Wolbachia的wsp基因序列比较

2．3 Cardinium的16S rDNA基因序列比较

3 讨论

第四章 Wolbachia和Cardinium菌量变化对CI的影响

1 材料和方法

1．1 叶螨总DNA的提取

1．2 实时定量PCR检测Wolbachia与Cardinium的菌量

1．3 质粒的连接转化反应及细菌的培养

1．4 质粒的提取

1．5 标准曲线的制定

2 结果

2．1 皮氏叶螨广东广州种群Wolbachia和Cardinium彼此对菌量的影响

2．2 皮氏叶螨广东广州种群Wolbachia和Cardinium彼此对菌量的影响

3 讨论

第五章 Wolbachia和Cardinium在皮氏叶螨生殖组织的定位

1 材料与方法

1．1 荧光原位杂交

2 结果

2．1 Wolbachia和Cardinium在雄虫生殖区的分布

2．4 Wolbachia和Cardinium在雌虫生殖区的分布

3 讨论

3．1 Wolbachia和Cardinium在精子形成过程中的分布对CI的影响

3．2 皮氏叶螨中Wolbachia和Cardinium的垂直传播模式

全文总结

参考文献

攻读硕士学位期间发表学术论文情况

致谢