猪繁殖与呼吸综合征病毒实时荧光RT-PCR检测方法的建立

摘要

猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductiveand Respiratory Syndrom Virus，PRRSV)属于动脉炎病毒科、动脉炎病毒属，主要引起怀孕母猪流产、死胎、木乃伊胎、早产、产弱仔等繁殖障碍和仔猪呼吸困难、高死亡率及育肥猪呼吸道症状。PRRS具有传播快、流行范围广、高度传染性的特点。PRRSV基因组全长约15 kb，不分节，舍8个开放性阅读框架(ORF)。国内外相关研究表明：PRRSV不同分离株的核苷酸序列存在明显差异，血清学实验和基因序列分析表明，PRRSV可划分为两种基因型毒株，即美洲株和欧洲株。目前我国所报道的分离株仅为美洲株。 实时荧光RT-PCR技术是近年来发展起来的一项新技术，该方法具有快速、灵敏、准确、低污染等优点，在PRRSV的早期检测、预防控制、进出口检疫及基础研究中起到重要作用。 1.美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒实时荧光RT-PCR检测方法的建立 从GenBank上调取PRRSV美洲株的基因序列，用DNAStar软件进行同源性分析，分别选择同源性较高的ORF1基因、ORF6基因，设计U1和U6两套PCR引物和荧光探针，经反应优化建立U1和U6荧光RT-PCR用于检测美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)。用10倍倍比稀释的质粒DNA、cDNA、RNA进行扩增以检测其灵敏度，同时对猪瘟(HCV)、猪伪狂犬(PRV)等7种病毒进行特异性检测。结果显示建立的U1和U6荧光RT-PCR可用于检测PRRSV，其灵敏度为10个拷贝的质粒DNA，与HCV等非PRRSV无交叉反应.建立的U1、U6荧光RT-PCR具有快速、灵敏、准确、低污染等优点，且能检测出现今流行的PRRSV变异毒株，可用于PRRSV样品的检测。 2.欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒实时荧光RT-PCR检测方法的建立 从GenBank上调取PRRSV欧洲株的基因序列，用DNAStar软件进行同源性分析，分别选择同源性较高的ORF1基因、ORF6基因，设计E1和E62套PCR引物和荧光探针，建立E1和E6荧光RT-PCR。经优化后用于PRRSV检测，并用10倍倍比稀释的质粒DNA、cDNA进行扩增以检测其灵敏度，同时对猪瘟(HCV)、猪伪狂犬(PRV)等7种病毒进行特异性检测.结果显示建立的E1和E6荧光RT-PCR检出PRRSV阳性，依次能检出616和216个拷贝的质粒DNA，而HCV等非PRRSV均为阴性。建立的E1、E6荧光RT-PCR可作为检测PRRSV的技术储备。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章猪繁殖与呼吸综合征病毒检测技术的研究进展

1病毒的分类与生物学特性

2 PRRSV基因及其编码的蛋白

3病毒的基因进化

4实验室检测技术

5结束语

参考文献

第二章美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒实时荧光RT-PCR检测方法的建立

引言

1材料与方法

2结果

3讨论

参考文献

第三章欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒实时荧光RT-PCR检测方法的建立

引言

1材料与方法

2结果

3讨论

参考文献

全文总结

致谢

硕士学习期间发表的论文