猪传染性胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白的克隆表达及其免疫原性分析

摘要

一、猪胸膜肺炎放线杆菌毒素II融合蛋白的纯化及其间接ELISA检测方法的建立 将猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropeumoniae，App)毒素ApxII的融合表达质粒pET-ApxII转化到BL21(DE3)，筛选高表达的克隆子用于诱导表达。应用亲和层析纯化ApxII作为抗原包被ELISA板建立检测App的ApxII-ELISA试剂盒。试验的最佳反应条件为：抗原包被浓度为10μg/mL，血清1：80稀释；一抗反应时间为90min，二抗反应时间为45min。与Cps-ELISA试剂盒平行检测172份临床血清显示该试剂盒具有良好的稳定性和重复性，并具有较高的特异性和敏感性。 二、猪胸膜肺炎放线杆菌外膜脂蛋白A(OmlA)部分基因片段的克隆表达 参照GenBank中App血清1、2、7型菌株的OmlA序列设计了一对特异性引物，用PCR方法扩增外膜脂蛋白A(OmlA)部分基因，分别得到994bp、1003bp和1000bp的片段，然后克隆到pMD18-T载体中。经测序比较，与GenBank中公布的序列(AB007572、AB007573和AB007579)核苷酸同源性分别为100％。从T载体中切下目的片段后，定向克隆到pET32a(+)中，转化BL21( DE3)。经诱导后，进行SDS-PAGE实验，证明获得56kDa的融合蛋白，目的基因高效表达；免疫转印鉴定呈阳性，外膜蛋白OmlA部分基因片段体外成功表达。 三、猪胸膜肺炎放线杆菌共同的外膜蛋白(AopA)部分基因片段的克隆表达 参照GenBank中App的外膜蛋白AopA基因序列设计了一对特异性引物，用PCR方法扩增外膜蛋白A(AopA)部分基因，得到1390bp的片段，然后克隆到pMD18-T载体中，经测序比较，与GenBank中公布的序列(U24492)核苷酸同源性为99％。从T载体中切下目的片段后，定向克隆到pET32a(+)中，转化BL21(DE3)，经诱导后，进行SDS-PAGE实验，证明获得69kDa融合蛋白，目的基因高效表达；免疫转印鉴定呈阳性，外膜蛋白AopA部分基因片段体外成功表达。 四、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白ICR小鼠免疫试验 通过基因工程技术分别表达了App的外膜蛋白rAopA、rOmlA1、rOmlA2和rOmlA7，分别免疫60只ICR小鼠，同时与rApxII组合免疫96只ICR小鼠；三免后分别用最小致死剂量的Appl型菌(2×107CFU)和App7型菌(4×108CFU)攻毒。结果显示，试验组保护效果优于对照组；rOmIA7和rAopA与rApxII组合免疫组的保护效果优于其他试验组和对照组，其中rOmlA7组合免疫的小鼠在抵抗Appl型菌攻击能力优于rOmlA1组合。试验证实App的外膜蛋白具有免疫原性，在抵抗App的攻击中起到一定的保护作用，且App的OmlA可能还可以提供交叉免疫保护。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一篇文献综述

1引言

2病原学

3流行病学

4致病机理

5毒力因子

6临床症状与病理变化

7检测技术的研究进展

8防治策略

参考文献

第二篇研究论文

第一章猪胸膜肺炎放线杆菌毒素Ⅱ融合蛋白纯化及其间接ELISA检测方法的建立

摘要

引言

1材料和方法

2结果

3讨论

参考文献

第二章猪胸膜肺炎放线杆菌外膜脂蛋白A(OmlA)部分基因片段的克隆、序列分析及表达

摘要

引言

1材料和方法

2结果

3讨论

参考文献

第三章猪胸膜肺炎放线杆菌共同的外膜蛋白(AopA)部分基因片段的克隆、序列分析及表达

摘要

引言

1材料和方法

2结果

3讨论

参考文献

第四章猪传染性胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白ICR小鼠免疫试验

摘要

引言

1材料和方法

2结果

3讨论

参考文献

全文总结

附录

致谢