不同致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒遗传变异分析与分子流行病学研究

摘要

猪繁殖与呼吸综合征是一种世界范围的猪病，给世界养猪业造成了巨大的经济损失。主要引起母猪繁殖障碍和新生仔猪呼吸道症状。病原猪繁殖与呼吸综合征病毒属动脉炎病毒科动脉炎病毒属成员，为正单股RNA病毒。基因组全长15kb左右，含有9个开放式阅读框。不同的PRRSV分离毒株之间存在遗传行、抗原性和致病性的差异。为了研究不同致病性PRRSV分离毒株致病性差异产生的分子机制和2002～2007年PRRSV分离毒株在我国的变异和进化，对本实验室不同时期分离的两株具有不同致病性的PRRSV分离毒株S1和SY0608进行了全基因序列测定和分析；对SY0608毒株在内的34株分离株进行了ORF5基因的分子流行病学研究；建立了检测PRRSV Nsp2基因缺失毒株的RT-PCR检测方法。 猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)S1毒株是本实验室于1997年从上海发病仔猪体内分离的中等致病力毒株。为了揭示其分子结构特征和与美洲毒株的亲缘关系，本研究对S1毒株进行了全基因序列测定。将S1基因组分成6个大小不等的基因片段进行扩增，其中上游片段的3'端和下游片段的5'端有部分基因序列重叠。首先应用RT-PCR方法分段扩增出包含PRRSV S1毒株大部分基因组的4条基因大片段，扩增的PCR产物经纯化后分别克隆于pCR-XL-TOPO载体，经鉴定后测序。然后应用RACE方法对包含毒株3'和5'基因末端的两个片段进行了成功的扩增并克隆于pMD-18T载体进行测序。利用测序序列之间重叠基因序列顺序将这些片断序列进行拼接，获得PRRSV S1株全基因组cDNA序列。测序结果表明，PRRSV S1毒株基因组全长15441 bp，包含8个开放式阅读框，5’端非编码区含有189nt，3’端非编码区舍有181nt，其中包含30nt的Poly (A)。基因组序列分析结果显示，该病毒与美洲型标准毒株ATCC VR-2332和中国早期分离株BJ-4的核苷酸同源性分别99.5％和99.6％。与另一国内分离株CH-1a的核苷酸同源性为90.8‰证明PRRSV S1毒株为美洲型传统毒株。 近年来在华东地区很多养殖场发生了一种严重的猪高热综合征，该病的主要特征是引起各种日龄的猪发热，皮肤发红，呼吸困难，神经症状明显，发病率和死亡率高，对保育猪和育肥猪引起的发病和死亡更高，而哺乳期的小猪发病率则相对较低。从2006年6月到12月，在临床诊断、病理变化观察和RT-PCR检测的基础上共有81个猪场诊断为PRRSV感染。将RT-PCR诊断为PRRSV阳性的病料经组织匀浆和无菌处理，然后接种于长满单层的Marc-145细胞进行病毒分离，结果从6个省市20个发生高热综合征的猪场分离到20株PRRSV分离株。 对其中的6株病毒进行了连续的噬斑纯化，将其中的一株病毒命名为SY0608毒株。SY0608毒株的生物学特性试验、间接免疫荧光试验、电子显微镜观察和RT-PCR鉴别诊断，证明SY0608株为美洲型PRRSV分离株。应用RT-PCR对毒株主要囊膜蛋白基因ORF5和非结构蛋白2(Nsp2)基因进行扩增后克隆至T载体。测序结果显示，ORF5基因和其它5株从高热病病例中分离毒株的核苷酸同源性为99.5％～99.8％，推导的氨基酸序列的同源性为98.2％～100％。但是同美洲标准毒株VR-2332相比，核苷酸同源性为89.4％，推导的氨基酸序列同源性为88.6％。SY0608毒株的非结构蛋白2(Nsp2)基因为2850bp，同VR-2332相比，核苷酸同源性为79.4％，而推导的氨基酸序列同源性为74.9％，在VR-2332 Nsp2蛋白对应的第480和531～559位分别缺失了1和29个氨基酸。用SY0608毒株接种不同日龄的PRRSV抗体阴性生长猪和妊娠后期的母猪。结果表明，SY0608能引起30日龄、65日龄和105日龄的生长猪100％的发病和25％～50％的死亡，接种母猪所产仔猪死产和弱仔数达到94.1‰与S1毒株的致病性相比，SY0608株的致病性明显增强。这些结果显示了一种新的高度变异的高致病性美洲型PRRSV已经在华东地区广泛传播。 为了揭示SY0608致病性增强的分子机制，本研究对高致病性PRRSVSY0608毒株进行全基因序列测定。将SY0608株基因组分成大小不等的8个基因片段进行PCR扩增，每个基因片段和相邻的片断都有部分序列重叠，同时应用RACE方法对基因组的5’末端和3’末端进行扩增。扩增后的PCR产物克隆至pMD-18T载体测序。将测序结果利用片段之间的重叠序列进行拼接，从而获得SY0608毒株全基因序列，并与传统PRRSV S1毒株全基因序列进行比较。结果表明：(1) SY0608毒株基因组全长15336bp，5’非编码区为189nt，3’非编码区为165nt。同S1相比，两个毒株之间的核苷酸同源性只有88.5‰其中ORF1b的同源性最低，其次是ORF5和ORF3。(2)将SY0608的核苷酸序列和推导的氨基酸序列与其它16株美洲型PRRSV分离株序列进行比较，并应用18株PRRSV殴美型分离株构建系统进化树。同传统毒株S1相比，SY0608在进化树中形成独立的分支，结果也显示，S1和SY0608可能来源于不同祖先VR-2332和P129。(3)将SY0608株的Nsp1～Nsp8、GP2～GP5、M和N蛋白与其它9株代表性毒株进行比较，结果显示，变异部位主要集中于Nsp2、GP3和GP5。(4)SY0608株GP5蛋白26和39位氨基酸之间糖基化位点(NGS)发生了变化，可能导致GP5的抗原性发生变化，并可能与病毒免疫逃选有关。(5)B细胞表位分析显示，SY0608缺失SP8表位和SP7表位的大部分，说明在Nsp2中可能存在病毒复制的非必需区，同时在Nsp2中B细胞表位的缺失能够降低机体对病毒的IgA和IgG应答，从而阻止病毒从组织中的清除。由此推测，PRRSV GP5蛋白糖基化位点的变化和Nsp2蛋白表位的缺失可能是造成病毒致病性增强的原因。 PRRSV欧美型分离株ORF5基因编码的囊膜糖蛋白变异程度很高。美洲型毒株中所观察到的大多数氨基酸替代都集中于靠近N端的高度变异区(26位和39位氨基酸之间)，这种变异也包含了NGS从0到3个的变化，这种变化和病毒的毒力具有一定的相关性。为了研究近5年我国PRRSV GP5的变异程度及可能的抗原性与致病力相关基因特征，本研究应用RT-PCR方法，对从2002～2007年本实验室分离的34株PRRSV分离毒株进行ORF5基因的扩增、测序和分析。结果表明，ORF5基因的高度变异区主要存在于信号肽部位和26～39位氨基酸之间，变异主要表现为NGS位置和数量的变化。12株ORF5基因高度变异株在26～39位氨基酸出现了3个NGS，其它11株ORF5基因高度变异株在该部位出现了2个NGS，但其中的10株44位的NGS缺失。因此我们推测26-39位氨基酸之间NGS的增加或44位NGS的缺失可能是造成病毒毒力增强的原因。系统进化分析显示，38株分离株在系统进化树上形成两个相对独立的亚群，高度变异毒株则全部位于sg(subgroup，sg)1中，ORF5基因高度变异毒株SH02于2002年已经开始出现在我国上海。同时发现在传统毒株和变异毒株之间存在RNA重组现象。研究表明，PRRSV可以通过基因变异和不同病毒分离毒株之间的基因重组进化。因此，加强PRRSV基因变异监测十分必要。 高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒流行堵住Nsp2基因存在90个核苷酸的缺失。为了快速检测Nsp2基因缺失毒株，本研究在对不同PRRSV分离株Nsp2基因核苷酸序列分析的基础上，选择该基因缺失部位上下游相对保守的部位。设计了一对兼并引物和一条基因特异性反转录引物，建立了诊断Nsp2基因缺失毒株的RT-PCR检测方法。传统PRRSV S1毒株和高致病性PRRSV流行株SY0608毒株的PCR扩增片段的大小分别768bp和678 bp，差异大小为90bp。特异性试验和敏感性试验证明该检测方法特异性好，但敏感性相对较低，可用于快速鉴定Nsp2基因缺失毒株和传统PRRSV毒株，从而为PRRSV的防治提供参考意见。 总之，本研究证明了Nsp2基因缺失和GP5蛋白糖基化位点的变化是造成病毒毒力增强的可能原因，而基因变异和RNA重组是导致PRRSV变异和进化的基础，这种变异会导致出现更强毒力的毒株和新型PRRSV。因此，加强我国PRRSV流行毒株基因变异监测十分重要。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章猪繁殖与呼吸综合征研究进展

1病毒受体与感染机理

1.1感染的细胞类型

1.2与PRRSV作用的细胞受体

1.3感染机理

2基因属性和基因组成

3基因的转录与表达

4非结构蛋白

4.1Nsp1蛋白

4.2 Nsp2蛋白

4.3其它非结构蛋白

5结构蛋白

5.1GP2a蛋白

5.2 GP2b蛋白

5.3 GP3蛋白

5.4 GP4蛋白

5.5 GP5蛋白

5.6 M蛋白

5.7 N蛋白

6病毒的遗传变异

6.1PRRSV基因组的遗传变异

6.2主要囊膜蛋白的变异

6.3次要糖蛋白的变异

6.4抗原性的变异

6.5致病性的变异

7免疫

7.1先天性免疫应答

7.2立即性先天性细胞应答

7.3获得性免疫应答

7.4 PRRSV的免疫调节与免疫逃避

8疫苗

8.1灭活疫苗

8.2弱毒疫苗

8.3基因工程疫苗

8.4 PRRSV通用型疫苗的发展前景

9 PRRSV的检测方法

9.1抗原检测技术

9.2抗体检测技术

参考文献

第二章猪繁殖与呼吸综合征病毒S1株全基因组序列测定与分析

摘要

引言

1材料与试剂

2方法

2.1Marc-145细胞培养和病毒增殖

2.2 PCR引物设计

2.3 S1株感染Marc-145细胞总RNA提取

2.4片断2～5的RT-PCR扩增

2.5 S1株基因组5’末端的扩增

2.6 S1株基因组3’末端的扩增

2.7片段2～5 PCR产物的克隆与鉴定

2.8 5’和3’RACE PCR产物的克隆与鉴定

2.9序列比较与分析

2.10系统进化分析

3结果

3.1 S1毒株基因组各片段的克隆与鉴定

3.2 S1毒株基因组序列测定和分析

3.3基因组核苷酸序列和推导的氨基酸序列与其它毒株的比较

3.4系统进化分析

4讨论

参考文献

第三章高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离与鉴定

摘要

引言

1材料和试剂

2方法

2.1临床病料

2.2 RT-PCR检测PRRSV

2.3 Marc-145细胞的培养

2.4病毒分离和纯化

2.5病毒生物学特性测定

2.6 TCID50测定

2.7间接免疫荧光试验

2.8病毒粒子观察

2.9 OKF5和Nsp2基因的扩增、克隆和鉴定

2.10实验猪的血清学检测

2.11SY0608毒株对青年猪的致病性

2.12 SY0608毒株对妊娠母猪的致病性

3结果

3.1临床症状与病理变化

3.2患病仔猪肺组织RT-PCR检测PRRSV

3.3病毒分离

3.4病毒生物学特性测定

3.5间接免疫荧光试验

3.6病毒粒子的电子显微镜观察

3.7分离病毒的RT-PCR鉴定

3.8 ORF5基因核苷酸序列和推导的氨基酸序列分析

3.9 Nsp2核苷酸序列和推导的氨基酸序列分析

3.10 ORF5基因和Nsp2基因遗传进化分析

3.11对青年猪的致病性

3.12对妊娠后期母猪的致病性

4讨论

参考文献

第四章猪繁殖与呼吸综合征病毒SY0608分离株遗传变异分析

摘要

引言

1材料与试剂

2方法

2.1引物设计

2.2 RNA的提取

2.3片段b～g的RT-PCR扩增

2.4 SY0608株基因组5’末端的扩增

2.5 SY0608株基因组3’末端的扩增

2.6片断a～h PCR产物的克隆与鉴定

2.7 GP3、GP5和Nsp2蛋白的抗原性和表面活性分析

2.8序列比较与分析

3结果

3.1扩增和测序结果

3.2核苷酸同源性分析

3.3非结构蛋白、GP3、GP5蛋白同源性的比较

3.4抗原性和表面活性分析

3.5不同阅读框的系统进化树分析

4讨论

参考文献

第五章2002～2007年猪繁殖与呼吸综合征病毒分离株ORF5基因分子流行病学研究

摘要

引言

1材料与试剂

2方法

2.1RNA提取

2.2 RT-PCR

2.3 PCR产物的克隆，鉴定及测序

2.4核苷酸序列和推导的氨基酸序列分析

2.5系统进化分析

3结果

3.1PCR扩增与克隆

3.2 ORF基因序列测定

3.3 ORF5基因同源性比较

3.4推导的氨基酸序列同源性比较

3.5糖基化位点（NGS）分析

3.6系统进化分析

4讨论

参考文献

第六章高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒流行毒株RT-PCR鉴别检测方法的建立

摘要

引言

1材料与试剂

2方法

2.1引物设计

2.2病毒感染细胞总RNA的提取

2.3 PCR反应条件的优化

2.4反转录

2.5 PCR

2.6敏感性试验

2.7特异性试验

2.8分离株的检测

3结果

3.1引物设计

3.2 PCR反应条件的优化

3.3敏感性试验

3.4特异性试验

3.5对PRRSV临床分离株鉴别检测

4讨论

参考文献

全文总结

致谢

攻读博士期间发表论文