白灵菇分类地位的评估及遗传多样性分析

摘要

本文针对前人在侧耳属分类研究中未曾将中国的白灵菇和典型的Pleurotusnebrodensis进行比较分析的缺陷，对来自中国的白灵菇菌株和来自欧洲的Pleurotusnebrodensis，Pleurotus ferulae，Pleurotus eryngii，Pleurotus elaeoselini菌株进行DNA分子标记（ITS，IGS2，SRAP）分析，从分子水平为白灵菇分类地位的确定提供可靠依据，同时研究了各侧耳种的系统发育关系和遗传多样性。主要研究结果如下：
　　 1、菌丝体形态和菌丝生长速度实验观察结果：PN802（1号）和PN803（2号）菌株在生长后期会产色素与其他供试菌株有明显的差异，但二者根据菌丝形态特征难以区分；菌株KH5（15号）、PF ds264（17号）、PF882（18号）的菌丝形态也与其它菌株明显不同，说明这些菌株与其他供试菌株的遗传背景有明显差异。其余供试菌株的菌丝体形态也有一定差异，但是组内各菌株无法区分。根据菌丝体生长速度数据，无法将供试菌株分类，但从数据中可以看出KH2（14号）和PF882（18号）菌株的生长速度显著快于其他菌株，说明这两株菌株与其他供试菌株的遗传差异较大。中国的白灵菇菌株比欧洲的Pleurotus nebrodensis菌株生长速度快，Pleurotus eryngii和Pleurotus elaeoselini菌株的菌丝体生长速度比其他侧耳种快。
　　 2、菌丝体拮抗反应试验结果：来自中国的绝大多数白灵菇菌株PN2，PN sn1，PN sn2，PN sn4，PN ts1，PN ts2，PN1（8、9、10、11、12、13和33号）分在一组，PN802（1号）和PNS03（2号）两株Pleurotus nebrodensis菌株分在一组，这与菌丝体形态特征观察的结果一致。PE ds77，PE ds359，PE4（27、28和32号）菌株分在一组，它们均为Pleurotus eryngii。3株Pleurotus elaeoselini菌株EL759，EL738，EL720（22、23和24号）分在一组。其它菌株各自独立成组。结果表明拮抗试验可以作为侧耳初步分类的方法。
　　 3、对ITS序列进行比对分析，结果显示全部供试菌株的ITS序列长度范围为534～589bp。从序列长度变异来看，ITS1区序列长度变化范围为184～255bp，稍大于ITS2区的180～200bp；5.8S序列相对保守，只有154bp和158bp两种长度。所有侧耳菌株无论是ITS1区还是ITS2区（G+C）％都比较低，ITS1平均为42.5％，ITS2平均为43.9％，G+C含量低说明其碱基置换具有很大的随机性。基于ITS序列信息，构建了34株供试菌株的系统发育树，结果显示：白灵菇与Pleurotus nebrodensis具有很近的亲缘关系，Pleurotus nebrodensis菌株的多态性更丰富；多数Pleurotus eryngii菌株聚在一组；3株Pleurotus elaeoselini聚在一起；Pleurotus ferulae菌株没有独立聚为一组。
　　 4、用4种识别四个碱基的内切酶对供试菌株进行IGS2-RFLP分析，其中3种酶的酶切效果较好。结果显示：每个菌株均存在3种酶的酶切位点，电泳后产生不同的带型。HaeⅢ酶切后产生21条条带，HhaⅠ酶切后产生13条条带，RsaⅠ酶切后产生19条条带，共计53条，其中多态性条带为52条，多态性比率为98％。3个内切酶都不能单独将全部供试菌株区别开，3种酶共同使用时，PN802（1号）和PN803（2号）两个菌株不能区分开，PN sn1，PN sn2，PN sn4 and PN ts2（9、10、11和13号）菌株不能区分开。根据IGS2-RFLP的信息构建系统发育树，结果与基于ITS构建的系统发育树显示的结果基本一致，不同的是3株Pleurotus elaeoselini没有聚在一起。
　　 5、用筛选出的7对扩增条带清晰、多态性丰富、稳定性好的引物组合对34株供试菌株进行SRAP扩增，共得到420条具有重复性的条带，且均为多态性条带，多态性比率为100％。每对引物的扩增效率不同，扩增条带数目为53～71条不等，平均每对引物扩增出60条条带，其中F1-R4扩增条带数最多，为71条条带。基于SRAP标记信息，构建了供试菌株的系统发育树，聚类分析结果与ITS基本一致，表明SRAP标记可以作为侧耳菌株分类和遗传多样性分析的有效技术手段。
　　 6、三种DNA分子标记分析结果表明，在一定相似性水平上，白灵菇与Pleurotusnebrodensis有很近的亲缘关系，二者很可能为同一菌种；Pleurotus nebrodensis菌株的多态性较白灵菇菌株丰富，说明中国的白灵菇菌株的遗传背景较单一；供试的Pleurotusferulae菌株不能聚在一组，各菌株之间遗传差异较大；SRAP标记技术可以作为侧耳菌株分类及遗传多样性研究的有效手段。

目录

文摘

英文文摘

第一章 文献综述

一、白灵菇的概述

1 白灵菇的营养价值和药用价值

2 白灵菇分类的国内外研究进展

二、分子生物学技术在食用菌分类和系统发育研究中的应用

1 限制性片段长度多态性(RFLP)

2 随机扩增多态性DNA(RAPD)

3 扩增片段长度多态性(AFLP)

4 内部转录间隔区(ITS)和转录单位间隔区(IGS)

5 内部简单重复序列(ISSR)

6 相关序列扩增多态性(SRAP)

三、研究目的和意义

第二章 白灵菇及其来自欧洲的近缘种的形态学鉴定

1 实验材料

2 实验方法

3 结果与分析

4 小结与讨论

第三章 白灵菇及其来自欧洲的近缘种的分子生物学分类鉴定

第一节 ITS序列分析

1 实验材料

2 实验方法

3 结果与分析

4 小结与讨论

第二节 IGS2-RFLP分析

1 实验材料

2 实验方法

3 结果与分析

4 小结与讨论

第三节 SRAP分析

1 实验材料

2 实验方法

3 结果与分析

4 小结与讨论

讨 论

参考文献

附 录

致 谢

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