猪链球菌毒力因子与免疫原性蛋白的筛选及斑马鱼模型转录组研究

摘要

猪链球菌（Streptococcus suis）是猪的重要致病菌，在全世界广泛分布，可以引起猪的急性败血症、脑膜炎、关节炎及急性死亡，也可导致生猪从业人员感染和死亡。根据荚膜多糖抗原的不同，猪链球菌分为35个血清型（1-34型，1/2型），其中猪链球菌2型(SS2)流行最广，从发病动物中分离率最高。此外，猪链球菌9型(SS9)也是一个重要致病血清型，与断奶仔猪的败血症、脑膜炎和肺炎的爆发有关，在澳大利亚、荷兰、比利时、德国等国家SS9流行较广。流行病学调查表明，在中国SS9也经常从病猪中分离到，并逐步呈上升趋势。目前，猪链球菌毒力因子及免疫原性蛋白的研究大都限于SS2，SS9的相关研究很少。本研究应用蛋白质组学方法筛选SS9毒力因子、SS9免疫原性蛋白、SS2与SS9共同抗原及基因芯片方法对猪链球菌斑马鱼模型的验证。
　　 1 SS9分泌蛋白比较蛋白组学研究
　　 应用比较蛋白组学方法，从两株不同毒力的SS9菌株分泌蛋白中检测致病性差异相关蛋白，以期发现SS9新的候选毒力因子。SS9菌株GZ0565与SH040917分别分离自病猪与健康猪。用斑马鱼模型评价两株细菌毒力，GZ0565对斑马鱼半数致死量为3.8×105cfu/鱼，而SH040917对斑马鱼不致病。同时，这两株细菌在猪链球菌已知毒力因子分布方面也存在差异。将病猪分离株GZ0565中有而健康猪分离株SH040917中没有的差异分泌蛋白经基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS),或MALDI-TOF-TOF-MS鉴定，分属于13种蛋白。其中5种蛋白报道与毒力相关(DNA核酸酶、O-乙酰丝氨酸裂解酶、含LysM结构的肽聚糖结合蛋白、磷酸甘油酸变位酶、5’－核苷酸酶），再用Southern杂交从基因水平验证，其中4种候选毒力因子对应基因在健康猪分离株SH040917中没有，这些蛋白的发现有助于进一步了解SS9的致病机制。
　　 2 SS9表面蛋白免疫蛋白组学研究
　　 利用免疫蛋白组学方法，以SPF小鼠抗SS9免疫血清作为一抗，与通过二维凝胶转印到PVDF膜上的SS9菌株GZ0565细胞壁蛋白杂交，从中鉴定12个免疫反应性蛋白斑点。从凝胶中切割相应的蛋白斑点，经MALDI-TOF-MS或MALDI-TOF-TOF-MS鉴定，属于8种免疫原性蛋白。它们分别是：精氨酸脱亚氨酸酶、胞外溶解物结合蛋白、延长因子TS、脑啡肽、多肽ABC运载体多肽结合蛋白、丙酮酸激酶、磷酸转乙酰酶、果糖二磷酸醛缩酶。上述免疫原性蛋白对应基因在SS9菌株中较保守，可作为SS9亚单位疫苗的候选成分。
　　 3应用免疫蛋白组学方法筛选SS2与SS9共同抗原
　　 SS2及SS9都可致猪链球菌病。研制共同疫苗是防控由SS2与SS9引起猪链球菌病的有效手段。采用免疫蛋白组学的方法，鉴定SS2与SS9共同抗原，为研制共同疫苗提供理论基础。分别以SPF小鼠抗SS2免疫血清、SS9免疫血清及免疫前对照血清作为一抗，与通过二维凝胶转印到PVDF膜上的SS2菌株HA9801细胞壁蛋白杂交，通过比较免疫转印蛋白图谱的差异，从中鉴定7个共同免疫反应性蛋白斑点。从二维凝胶中切割相应的蛋白斑点，经MALDI-TOF-MS分析鉴定，分属于4种蛋白：精氨酸脱亚氨酸酶、延长因子TS、O-乙酰丝氨酸裂解酶和1－磷酸果糖激酶。从SS9菌株GZ0565中克隆表达这4种蛋白，用SPF微型猪SS2康复血清通过免疫转印方法进一步验证其免疫原性。上述免疫原性蛋白对应基因在SS2和SS9菌株中相当保守，可作为SS2和SS9疫苗的候选成分。
　　 4斑马鱼感染猪链球菌后转录水平的变化
　　 猪链球菌是猪的重要致病菌，然而，用普通猪判定细菌的毒力问题较多，结果不确定，阻碍了猪链球菌致病机理的研究。与猪相比，斑马鱼价廉易得、体型小、操作方便，特别适合于突变库中突变株毒力的判定。本实验室已经成功地将斑马鱼作为猪链球菌的感染模型，并且被国际兽疫局所引用。应用Affymetrix斑马鱼芯片研究斑马鱼感染SS2菌株HA9801后基因表达的变化。在总共有14900转录本的芯片中，有189个基因发生变化，其中125个基因上调表达，64个基因下调表达。在上调的基因中，若干基因的功能与免疫和炎症反应、凝血过程、补体激活及急性阶段反应及应激或防御反应有关，研究表明其中有三个基因（编码血清淀粉样蛋白A、基质金属蛋白酶9和凋亡相关半胱氨酸蛋白酶）在其它物种中与猪链球菌感染后的反应相同。下调基因有肌肉特异基因和与运动或行为的正调控有关的基因。挑选12个基因应用实时定量PCR对芯片数据进行验证，结果与芯片的数据吻合。上述发现有助于用斑马鱼模型进一步探索猪链球菌的致病机理。

目录

文摘

英文文摘

英文缩写词表

第一篇 文献综述

第一章 猪链球菌研究进展

1 病原学与流行病学

2 毒力因子

3 致病性与致病机理

4 疫苗研究

5 动物模型

参考文献

第二章 蛋白质组学与基因芯片及其在细菌中的应用

一、蛋白质组学及其在细菌中的应用

二、基因芯片及其在细菌中的应用

参考文献

第二篇 试验研究

第三章 猪链球菌9型分泌蛋白比较蛋白组学研究

1 前言

2 材料与方法

3 结果与讨论

4 结论

参考文献

第四章 猪链球菌9型表面蛋白免疫蛋白组学研究

1 前言

2 材料和方法

3 结果

4 讨论

参考文献

第五章 应用免疫蛋白组学方法鉴定猪链球菌2型与9型共同抗原

1 前言

2 材料和方法

3 结果

4 讨论

参考文献

第六章 斑马鱼感染猪链球菌后转录水平的变化

1 前言

2 材料和方法

3 结果

4 讨论

参考文献

全文总结

致谢

博士期间发表及待发表的文章