抗菌肽LL-37和Misgurin基因合成及其在毕赤酵母中的表达

摘要

抗菌肽是存在于生物体内具有抵抗外界微生物侵害，消除体内突变细胞的一类由生物细胞特定基因编码产生的小分子多肽，多具有广谱的抗菌活性，是生物机体先天性免疫防御体系的重要组成部分。目前已从包括两栖动物、昆虫、哺乳动物、植物、原核生物中分离到超过2000种具有抗细菌、真菌和病毒等抗菌活性的抗菌肽。但从生物体提取抗菌肽根本无法满足实际应用的需要，而化学合成抗菌肽又太昂贵。因此利用基因工程的方法将人工合成的抗菌肽基因导入宿主细胞，再通过微生物发酵的方法生产抗菌肽更具实际意义。本研究的目的就是应用基因工程技术获得重组的人源抗菌肽LL-37和来自泥鳅的抗菌肽Misgurin，以期为工业化生产和临床应用打下基础。
　　 根据GenBank中LL-37（P49913）和Misgurin（P81474）中的氨基酸序列，选用酵母偏爱密码子设计相应的抗菌肽基因L和M。并在它们的N端都引入了α交配因子信号肽Kex2酶切位点，以保证表达的抗菌肽具有天然的N端。C端引入谷氨酰胺以增加抗菌肽的酰胺化程度，增强其抗菌活性。然后分别将抗菌肽基因L和M克隆至酵母分泌型表达载体pPICZα-A中，构建重组真核酵母表达质粒pPICZα-A-L和pPICZα-A-M。测序结果表明，LL-37和Misgurin的基因已正确亚克隆至真核表达载体pPICZα-A上。
　　 大量提取重组真核表达载体质粒，并以pPICZα-A表达载体为对照，经SacⅠ线性化后电转化法转化至酵母菌SMD1168株。经浓度逐步增加的ZeocinTM抗性YPDS平板筛选获得高拷贝的阳性重组酵母菌pPICZα-A-L/SMD1168和pPICZα-A-M/SMD1168。在含甘油的BMGY培养基增菌至OD600达5～6后，转至含有甲醇的诱导培养基BMMY中进行摇瓶发酵，每隔24h补加100％甲醇使终浓度达0.5％。采用琼脂孔扩散法进行抑菌活性测定，结果显示重组酵母菌pPICZα-A-L/SMD1168和pPICZα-A-M/SMD1168的表达上清都具有广谱抗菌活性，对金黄色葡萄球菌CowanI，大肠杆菌K88、K99、987P、KD，猪沙门氏菌C782等都显示了一定的抗菌活性，表明抗菌肽LL-37和Misgurin的基因在SMD1168中得到成功分泌表达。热稳定性测定结果表明，重组抗菌肽LL-37能抗沸水浴10min，30min后仍具有约40％活性；而重组抗菌肽Misgurin对高温具有较强的耐受性，能耐沸水浴40min，1h后活性仍保留约70％。

目录

文摘

英文文摘

第一篇 文献综述

第一章 抗菌肽的概述

1 抗菌肽的来源

2 抗菌肽的结构和分类

3 抗菌肽的生物学活性及功能

4 抗菌肽的作用机制

5 抗菌肽的开发及应用

6 抗菌肽应用前景展望

参考文献

第二篇 实验部分

第二章 LL-37的合成及其在毕赤酵母中的分泌表达

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第三章 Misgurin的合成及其在毕赤酵母中的分泌表达

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

全文总结

致谢