mae和misgurin两种基因表达载体的构建及其在毕赤酵母中的表达

摘要

MAE是本实验室设计的具有抗菌活性的杂合肽，它是以MagaininⅡ(残基4-14)和Melittin(残基2-13)为亲本，并对序列进行了优化改造后设计出的杂合肽。本文对杂合肽的高级结构进行了模拟，得到了该杂合肽高级结构的初步信息。并以已构建的载体pTYB2-mae为模板，通过PCR扩增出融合基因mae-imein-cbd，将其克隆于表达质粒pPIC9K中，通过鉴定并测序正确后，电转化真核表达宿主——毕赤酵母菌株GS115，通过营养缺陷型培养基筛选重组子，再利用G418抗性筛选出整合有多拷贝外源基因的重组子。按表达手册进行表达实验，挑选出具有高分泌表达水平的菌株，并采用不同的诱导时间、pH值、甲醇诱导浓度进行表达比较，优化出适宜的表达条件。采用优化的表达条件进行大量发酵，对上清液超滤浓缩脱盐后，采用几丁质基质进行亲和层析分离目的蛋白，溴化氰切割，琼脂孔穴法测抗菌活性。结果表明，纯化后的产物具有明显的抗菌活性。Misgurin是一种从泥鳅中分离出来的，具有强抗菌活性而无溶血活性的抗菌肽，因而有望成为一种抗菌新药。

目录

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前言

第一部分 抗菌肽MAE的高级结构模拟

第二部分 表达载体pPIC9K-mae的构建及基因在毕赤酵母中的表达

第三部分 表达载体pPIC9K-mmis的构建及初步表达

第四部分 讨论

小结

参考文献

附录

致谢