猪卵母细胞单精子胞浆内注射及体外发育研究

摘要

单精子胞浆内注射（jntracytoplasmic sperm injection，ICSI）技术已在许多动物上获得成功，在猪上也已获得ICSI后代。随着转基因动物及胚胎生物技术研究的深入发展，猪ICSI研究越来越受到人们的重视。当前，猪ICSI胚胎生产的效率仍然较低，许多因素制约着猪ICSI成功率，相关机理了解较少。本研究借助于显微操作技术，将猪冻精注入体外成熟（IVM）卵母细胞内，通过对注射卵进行体外培养与观察，了解猪ICSI胚胎发育情况，比较不同激活、不同成熟培养方法及在胚胎培养液中添加L-cys、采用共培养技术等对ICSI胚胎体外发育的影响，并比较冻精ICSI胚胎和体外受精（in vitro fertilization，IVF）胚胎的体外发育能力；应用Real-time PCR技术检测DNA甲基化相关基因（DNMT1和DNMT3A）及抗凋亡基因Bcl-2的表达规律，实验内容和结果如下：
　　 1.猪ICSI胚胎注射后，分别使用电激活和电激活与化学激活联合激活的方法对ICSI胚进行激活，结果表明，猪ICSI胚电激活后，在NCSU-23中培养4 h，然后转入到添加2 mM的6-DMAP的培养液中培养6 h，再移入NCSU-23中进行继续培养，胚胎卵裂率可达75.6％，明显高于单纯电激活组的卵裂率（68.3％）；但2种激活方法对其囊胚发育率的影响差异不显著（P>0.05）。
　　 2.用3种不同的成熟培养液对猪ICSI激活后胚胎进行培养，用不舍BSA的NCSU-23进行IVM，所获得卵母细胞进行ICSI操作后体外培养48 h后，卵裂率达78.3％，明显高于用TCM199+10％NCS组和0.1％PVA组（分别为67.6％和64.8％），但3组间桑椹胚发育率和囊胚发育率差异不显著（P>0.05），说明卵母细胞的成熟方法并不影响ICSI胚胎的发育。
　　 3.先在含1.71 mM L-cys的NCSU-23培养液中培养3 h后，再转入不含L-cys的培养液中培养，卵裂率和囊胚率与对照组相比，差异均不显著，表明添加L-cys并未改善ICSI胚胎的发育状况。
　　 4.经激活处理的猪ICSI胚胎分别与颗粒细胞、卵丘细胞进行共培养，或直接放入NCSU-23培养液中培养，结果表明，采用颗粒细胞或卵丘细胞共培养猪ICSI胚胎，卵裂率较对照组有大大提高，其中与卵丘细胞共培养的ICSI胚胎卵裂率高达93.3％，但各组囊胚发育率没有明显变化（P>0.05）。
　　 5.用本实验室制备的猪冷冻精子进行ICSI和IVF研究，所获胚胎分别进行体外培养，比较不同来源的猪IVP胚胎体外发育能力。结果表明，用冻精生产的ICSI胚卵裂率和囊胚发育率分别为68.3％和11.4％，均低于用冻精进行IVF所获的76.9％卵裂率和19.2％囊胚率（P<0.05）。
　　 6.本实验以猪GV期、MⅡ期卵母细胞和猪IVF和ICSI2-细胞，4-细胞、8-细胞、16-细胞和桑椹胚期胚胎为研究对象，采用Real-time PCR技术对与DNA甲基化相关基因（DNMT1，DNMT3A）的表达变化规律进行研究。结果发现，在卵母胞成熟过程中，DINMT1 mRNA持续高水平表达；在胚胎发育早期，IVF胚胎和ICSI胚胎的DNMT1mRNA的表达量均急剧降低，可能与胚胎早期去甲基化有关；与IVF胚相比，ICSI胚胎DNMT1具有相同的表达趋势，只有在4-cell时高于IVF胚。DNMT3AmRNA在卵母细胞成熟过程中就开始急剧下降，经2-8cell阶段的低水平表达后又开始上升；与IVF胚相比，ICSI胚8-cell后DNMT3AmRNA表达量小于IVF胚。
　　 7.采用Real-time PCR技术对猪IVF、ICSI胚胎不同发育时期Bcl-2 mRNA的表达进行相对定量分析，结果表明随着胚胎的不断发育，IVF与ICSI胚胎的Bcl-2 mRNA表达量均逐渐下降，且ICSI胚胎的下降趋势较IV胚胎明显，说明胚胎抑制凋亡的能力下降，这可能是造成胚胎凋亡的主要原因。

目录

文摘

英文文摘

基金项目

简写及缩略语

第一部分 文献综述

第一章 猪单精子胞浆内注射技术研究进展

1 单精子胞浆内注射的研究简史

2 猪单精子胞浆内注射的研究现状

3 单精子胞浆内注射的操作程序

4 影响ICSI效果的因素

5 DNA甲基化对ICSI胚胎发育的影响

6 存在问题

7 应用前景

参考文献

第二部分 试验研究

第二章 用冻精体外生产猪ICSI胚胎研究

摘要

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

参考文献

第三章 猪ICSI胚胎培养过程中DNA甲基化水平的变化

摘要

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

参考文献

全文总结

附录一 溶液配置

附录二 图版及说明

致谢