高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒JX143株的致弱及其应用

摘要

猪繁殖与呼吸障碍综合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS）是一种以母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道症状为特征的严重接触性传染病，它的致病病原是猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（PRRSV），PRRSV分为欧洲型和北美型，其代表株分别被命名为Lelystad Virus和VR-2332。自1987年发现PRRSV以来，PRRS在世界范围内迅速蔓延而成为养猪业的重要威胁。2006年以来，“猪高热综合征”肆虐我国养猪业，高致病性猪蓝耳病是其主要致病病原之一，给我国养猪业造成了巨大的经济损失。现有疫苗在免疫原性以及交叉保护性方面的作用均值得商榷，此外对于蓝耳病病毒的毒力因子的探寻仍无定论。本实验室拥有高致病性PRRSV JX143的感染性克隆并通过细胞上连续传代得到了致弱毒株JXM100，构建了JXM100的感染性克隆pAJXM。之后建立同源毒株之间结构蛋白和非结构蛋白的嵌合，并获得嵌合感染性克隆和相应的嵌合病毒，为界定高致病性猪蓝耳病的毒力因子和多价疫苗的研制奠定了基础。现将研究内容简述如下：
　　 1.高致病性猪繁殖与呼吸综合征JX143株的致弱
　　 高致病性蓝耳病近年来在我国广泛流行，目前尚无高效疫苗用于该病的防制。本研究通过有限稀释法，将高致病PRRSV毒株JX143在Marc-145细胞上系列传代获得JX143的致弱株JXM100。全基因序列分析表明JXM100与pJX143有99.5％的相似性，其中有74处发生核苷酸突变，32处为有义突变，这些差异为寻找可能的毒力因子奠定了基础。JXM100的变异还具有独特性，不同于其他毒株，尤其是Nsp2区域中88个氨基酸的连续性缺失，这为我们开发一种可以与野毒株和其他毒株相区分的疫苗候选株带来了希望。
　　 2.JXM100感染性克隆的构建
　　 通过RT-PCR，分4段克隆相互间首尾重叠并覆盖全长PRRSV基因组cDNA片断，最后进行CMV启动子的安装以及全长cDNA克隆的连接装配入pBluescriptⅡKS（+）载体，命名pAJXM。通过质粒DNA转染Marc-145细胞进行病毒拯救，成功拯救出一株遗传稳定的病毒AJXM。并对拯救病毒进行病毒学及分子生物学鉴定，结果表明，拯救病毒的空斑形态、一步生长曲线与亚基因组的表达等与亲本病毒相似。这一平台的建立，为进一步研究病毒致弱机制和寻找可能的毒力因子具有重要意义。
　　 3.同源强弱毒PRRSV嵌合感染性克隆的构建及鉴定
　　 对强、弱毒株进行全基因序列分析，利用DNASTAR软件进行分析后，选取合适的酶切位点。以感染性克隆pJX143M和pAJXM为骨架，利用强弱株中共有的合适的酶切位点和SOE PCR技术构建了一系列结构蛋白和非结构蛋白的嵌合感染性克隆pAJXM1/JX、pJX1/AJXM、pAJXM1a/JX、pJX1a/AJXM、pAJXM1b/JX、pJX1b/AJXM、pAN23JX、pAN3JX、pJXN1-3/AJX、pAJX1-3/JX、pJXN4-6/AJX和pAN4-6/JX。通过质粒DNA转染Marc-145细胞进行病毒拯救。并对对拯救病毒进行病毒学及分子生物学鉴定，结果发现，嵌合病毒与亲本病毒在生长特性有明显差异，推测其可能的细胞致弱因子可能存在于ORF1a，ORF1a这一区域导致与此区域有关的细胞嗜性的功能区造成变化而导致的。细胞致弱因子可能不是由单个NSP所决定，可能是一个NSP之间的相互作用才会导致病毒在细胞上的毒力增强，这些都需要进一步验证。在本研究中，构建同源强弱毒间PRRSV不同结构域嵌合感染性克隆病毒为开发同时抗经典和变异株PRRSV感染的二价疫苗，以及探寻有可能影响高致病性猪蓝耳病病毒的毒力因子的结构域奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

符号说明

第一篇 文献综述

第一章 猪繁殖与呼吸综合征研究进展

病原学

病毒基因组

病毒基因组编码的蛋白与其功能

致病机理

猪高热综合症

PRRS的防制

小结

参考文献

第二章 病毒的进化

摘要

Abstract

病毒的起源

病毒的进化遗传学

病毒进化的机制

准种与错误极限

瓶颈效应

结语

参考文献

第二篇 试验研究

第三章 高致病性PRRSV的致弱及其致弱株JXM100的序列分析

摘要

Abstract

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第四章 JXM100感染性克隆的构建及其生物学特性分析

摘要

Abstract

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第五章 PRRSV强、弱毒株嵌合感染性克隆的构建及鉴定

摘要

Abstract

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

全文总结

致谢