水稻磷酸盐转运蛋白OsPht1;2和OsPht1;6表达调控和功能的研究

摘要

磷是最为重要的生命元素之一，几乎参与所有生命的重要代谢活动。由于化学和微生物的强烈固定，大多数自然土壤中的有效磷很低，限制着植物的生长发育。植物可以通过改变根系形态结构和增强分泌物质提高土壤生物有效态磷，但最终需要通过植物根系高效的吸收和转运系统-“磷酸盐转运蛋白”来完成吸收和转运。一般认为，Pht1家族磷转运蛋白可能是植物从根系磷的吸收到体内磷转运的主要完成者。水稻是最重要的粮食作物之一，也是最为重要的模式作物。因此研究水稻在磷胁迫环境下的逆境反应分子机制，并对其进行遗传改良具有重大的现实意义.在水稻基因组有13个基因编码的蛋白属于Pht1高亲和磷转运蛋白家族，其中OsPht1;11（OsPT11）和OsPht1;13（OsPT13）受菌根特异性诱导表达，然而其他基因在吸收和转运磷素中的功能尚不清楚。通过RT-PCR方法，我们发现在该家族基因中OsPht1;2和OsPht1;6在缺磷条件下转录水平表达量最大。鉴于在过去发表的文章中已经将该家族的磷酸盐转运蛋白简单定义为OsPT，为了便于比较和简单化，本文中所研究的两个基因分别采用OsPT2和OsPT6命名。本研究以模式品种日本晴(Nipponbare)为材料，通过RT-PCR、转基因和蛙卵等异源表达体系、电生理等方法研究了OsPT2和OsPT6的功能和表达调控，所获得的主要结果如下：
　　 1.通过对OsPT2和OsPT6两基因的氨基酸序列比对以及其磷酸化位点、糖基化位点、跨膜性等方面分析得出OsPT2和OsPT6具有Pht1家族基因的典型特征，它们的同源性达到70％。通过序列比对分析，表明OsPT2和OsPT6在水稻基因组中都是以单拷贝形式存在，两者都没有内含子。OsPT2基因位于第3条染色体，而OsPT6基因位于第8条染色体。系统进化树分析表明，OsPT2和OsPT6基因在Pht1家族基因里面不属于同一个小亚类，说明它们在功能上可能存在差异。对OsPT2和OsPT6基因启动子序列分析发现，两个基因的启动子里面都含有两个W-box，一个P1BS，而在OsPT6基因启动子序列中发现了两个PHO-like element基序，据前人研究这三个可能是参与磷饥饿信号的调控因子在下游基因启动子中的结合位点（元件）。
　　 2.OsPT2和OsPT6分别与GFP融合，形成的融合蛋白在洋葱表皮细胞表达分析表明OsPT2和OsPT6都定位于细胞质膜上，说明它们确实是质膜蛋白基因，符合Pht1家族的基本特性。通过RT-PCR分析，表明OsPT2和OsPT6在缺磷条件下在根部均强烈增强表达；在叶片中缺磷同样导致OsPT6表达的明显增强，但OsPT2的表达量增强相对较弱。
　　 3.为了研究OsPT2和OsPT6基因的时空表达和对磷饥饿的响应，我们扩增了OsPT2和OsPT6基因ATG上游5’端序列，长度分别为1670bp和2380bp用作表达分析，GUS基因作为报告基因，用来检测两个基因的时空表达。把重组的质粒转入日本晴水稻中，并且整合到染色体上，经过转基因得到Ti代转基因苗，在高磷和低磷处理时来分析OsPT2和OsPT6基因的时空表达谱。我们发现在缺磷三周后，OsPT2基因表达部位主要集中在根尖、侧根发生区和根茎结合部的中柱部分。从组织切片结果可以看到，GUS报告基因主要在根尖的导管薄壁细胞中有表达，而表皮和皮层均未发现GUS基因表达；在侧根发生区，同样只有在中柱部位有明显表达；在根冠部位没有发现有GUS表达。说明OsPT2在缺磷或者低磷环境中主要负责把根中的磷酸盐转运到地上部去。
　　 同样缺磷处理三周后，OsPT6基因在幼嫩的主根，侧根和根茎结合部位有明显的GUS基因表达，而在供应了0.3 mM Pi处理植株中，没有发现这些部位有报告基因的表达。OsPT6基因在幼根和侧根的表皮、皮层和中柱细胞均有很强的表达。但是侧根发生区，在主根的表达减弱，而在侧根生长点表达很强。同时也发现，在根冠部位没有GUS表达。说明OsPT6在缺磷或者低磷环境中同时负责吸收和运输磷酸盐。
　　 我们还发现，在缺磷条件下在叶片中均检测出OsPT2和OsPT6两个基因各自的内源启动子所驱动的GUS表达，而在正常供磷条件下其表达明显减弱。OsPT2和OsPT6两个基因在一些成熟器官中也有表达。OsPT2在灌浆期种子和发芽种子中表达，OsPT6在花药和发芽种子中都能检测到。
　　 4.蛙卵细胞中表达OsPT2和OsPT6可使细胞中磷的吸收量分别提高5倍和7倍，微电极测定细胞膜电位变化分析发现供应1 mM Pi可使表达OsPT2的蛙卵细胞去极化，这种去极化程度随着供应的磷浓度提高到10 mM而大幅提高。表明OsPT2是低亲和力的磷酸盐转运蛋白，而且是2个摩尔以上质子与1个摩尔H2PO4-的共转运或3个摩尔以上的质子与1个摩尔HPO42-的共转运蛋白。然而表达OsPT6的蛙卵细胞检测不到介质磷酸盐的供应对细胞膜电位的变化，表明有别于OsPT2， OsPT6可能是一个高亲和力的磷酸盐转运蛋白，也可能是与质子共转运但净电荷呈中性的磷酸盐转运蛋白。
　　 5.通过泛素启动子驱动OsPT6在水稻（日本晴）中的超表达，获得了在正常供磷条件下与野生型相比OsPT6显著增强的多个株系.在正常供磷条件下OsPT6的过量表达能大幅提高水稻地上部分磷的积累，植株表现出矮小，老叶枯斑和枯死等磷毒害症状.这种类似磷毒害症状能随着外源供应磷的浓度下降而得到缓解，说明OsPT6参与调控了水稻体内磷素的平衡。
　　 6.通过构建含有可能与磷信号转录因子结合的不同基序以及拷贝数的启动子与GUS报告基因融合基因转化水稻，发现在水稻体内P1BS和W-box两种基序为磷饥饿反应的结合元件，它们是水稻OsPT6基因磷饥饿下高度特异表达调控的关键元件，同时发现W-box的拷贝数与该基因在缺磷或者低磷条件下的表达丰度相关，拷贝数越大表达量越强。
　　 综合上述结果，我们认为水稻体内存在非常复杂的磷信号途径。尽管OsPT2和OsPT6均是缺磷增强表达的磷酸盐转运蛋白，但它们可能接受上游的磷信号途径不完全相同，两者的表达部位、对磷酸盐的亲和力和对介质酸度的要求等功能方面表现很大的差异。利用不同磷素供应条件和不同部位表达的特异和人工启动子有可能能改变它们的表达部位和丰度等，从而有可能通过转基因培育适应不同供磷条件和环境pH的磷素高效吸收利用的水稻新品种。

目录

文摘

英文文摘

项目基金资助

缩略语

第一章 文献综述

引言

1 植物低磷胁迫反应研究进展

1.1 在缺磷条件下植物的形态学变化

1.2 植物磷营养逆境反应的生理学机制

1.3 植物对低磷营养胁迫的分子机制研究进展

2 植物磷酸盐转运蛋白基因的研究进展

2.1 高亲和磷酸盐转运蛋白的结构特征

2.2 高亲和磷酸盐转运体编码基因的表达特征和功能鉴定

2.3 Pht1家族磷转运蛋白与植物中磷信号传导调控因子

第二章 水稻OsPT2与OsPT6基因信息学分析

引言

1 方法

1.1 OsPT2与OsPT6基因序列的分析

1.2 OsPT2与OsPT6氨基酸序列分析

1.3 OsPT2与OsPT6两个磷酸盐转运蛋白的跨膜拓扑模型分析

1.4 OsPT2和OsPT6基因启动子分析

1.5 OsPT2和OsPT6与Pht1家族其它磷酸盐转运蛋白的系统进化分析

2 结果与分析

2.1 OsPT2与OsPT6结构和跨膜分析。

2.2 OsPT2和OsPT6基因启动子分析

2.3 OsPT2和OsPT6与Pht1家族磷酸盐转运蛋白的系统进化树分析

3 讨论

第三章 OsPT2和OsPT6基因的表达分析

引言

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果与分析

2.1 OsPT2和OsPT6基因的表达特征

2.2 OsPT2和OsPT6基因的时空表达分析

2.3 OsPT2和OsPT6亚细胞定位分析

3 讨论

第四章 利用蛙卵异源表达系统分析OsPT2和OsPT6的功能特征

引言

1 材料和方法

1.1 材料

1.2 方法

1.3 蛙卵中磷吸收量的测定

2 结果与分析

2.1 通过蛙卵中磷含量和蛙卵膜电位的变化分析OsPT2的功能。

2.2 通过蛙卵中磷含量和蛙卵膜电位的变化分析OsPT6的功能。

3 讨论

第五章 利用OsPT6基因超表达材料分析OsPT6的功能特征

引言

1 材料和方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果与分析

2.1 OsPT6基因超表达转基因株系的鉴定

2.2 OsPT6基因超表达株系正常磷处理30天的表型分析及有效磷含量的测定

3 讨论

第六章 水稻OsPT6基因启动子中缺磷响应元件的分析

引言

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果与分析

2.1 启动子结构分析

2.2 启动子不同片段对OsPT6基因受低磷诱导表达的影响

3 讨论

第七章 结论与展望

1 结论

(1) 通过对OsPT2和OsPT6两基因的氨基酸序列比对以及其磷酸化位点、糖基化位点、跨膜性等方面分析得出OsPT2和OsPT6具有Pht1家族基因的典型特征。

(2) OsPT2负责磷酸盐从根部到地上部的运输

(3) OsPT6具有吸收和运输磷酸盐双重作用

2 展望

参考文献

创新点

附录

研究生期间发表论文

致谢