莱克多巴胺单克隆抗体免疫检测试剂的研制和应用

摘要

莱克多巴胺（Ractopamine，RCT）是一种β肾上腺素能兴奋剂，具有营养再分配、促进蛋白质合成的作用。莱克多巴胺可能被非法作为动物饲料添加剂，以提高饲料转化率和增加瘦肉率，但其残留对人类健康存在潜在的危害。本研究旨在制备特异性针对莱克多巴胺的单克隆抗体，并建立竞争酶联免疫吸附试验(ciELISA)和免疫胶体金试纸条用于莱克多巴胺残留的检测。
　　 采用混合酸酐法将莱克多巴胺与匙孔蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)偶联，经紫外光谱扫描确定偶联成功，测得偶联物RCT-KLH浓度为3.6mg/mL，RCT-BSA浓度为6.2mg/mL。以偶联物RCT-KLH作为免疫原，免疫6-8周龄雌性BALB/c小鼠，取小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞SP2/0-Ag-14进行融合。以RCT-BSA作为包被抗原，经间接ELISA筛选出阳性细胞株，再用有限稀释法进行多次亚克隆，获得稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞10株，分别为1D9、1F3、2Cll、5C3、3A10、4A8、687、6D5、7Cll、7D3，其中单克隆抗体5C3和3A10间接ELISA效价均为1:500000。间接竞争ELISA显示，单克隆抗体5C3对莱克多巴胺的50％阻断作用浓度(ICso)为3.98ng/mL，对盐酸克伦特罗和沙丁胺醇的IC50均大于2000ng/mL;对盐酸克伦特罗和沙丁胺醇的交叉反应率均小于0.2％。
　　 以单克隆抗体5C3为核心试剂，建立了间接竞争ELISA检测莱克多巴胺的方法，并研制出ELISA试剂盒，以混合酸酐法人工合成的莱克多巴胺-卵清蛋白(RCT-OVA)为包被抗原，莱克多巴胺为竞争的半抗原，两者与一定量的抗莱克多巴胺单克隆抗体5C3在竞争体系中反应。试验结果表明，包被抗原的最佳稀释浓度为1:1600，抗莱克多巴胺单克隆抗体5C3工作浓度为1:8000，包被抗原37℃包被3h为最佳包被条件。间接竞争ELISA检测莱克多巴胺标准品检测线性范围为0.5～100ng/mL，最低检测限为0.5ng/mL，标准曲线的相关系数(R2)达到0.9968。试剂盒的样品检测离散系数(CV)不高于3.4％，阳性添加回收率平均达到99.2％。对猪饲料、肝脏、尿液样品，ELISA试剂盒的检测限分别为0.01mg/kg、0.01mg/kg和0.5ng/mL。经厦门出入境检验检疫局检验检疫技术中心、四川出入境检验检疫局、南通市畜产品质量检验测试中心和南京市栖霞区畜牧兽医站等四家单位对人工添加菜克多巴胺样品进行检测，结果显示当样品中莱克多巴胺浓度>0.5ng/mL时，本研究中研制的ELISA检测试剂盒与德国拜法食品安全检测和饲料监控分析公司生产的莱克多巴胺ELISA检测试剂盒的检测符合率达95％以上。
　　 采用混合酸酐法制备的RCT-OVA偶联抗原和胶体金标记莱克多巴胺单克隆抗体5C3，建立了检测莱克多巴胺的胶体金免疫层析试验方法，并组装成标准化检测卡。该检测卡具有较好的敏感性和特异性，最低可检测10ng/mL的莱克多巴胺，而与克伦特罗和沙丁胺醇无交叉反应。应用该方法对饲料、组织和尿液样品中莱克多巴胺的最低检测量分别为0.05mg/kg,0.05mg/kg和10ng/mL.经厦门出入境检验检疫局技术中心、四川出入境检验检疫局、南通市畜产品质量检验测试中心和南京市栖霞区畜牧兽医站等四家单位对人工添加样品进行检测，结果显示当样品中莱克多巴胺残留浓度>10ng/mL时，本研究中研制的胶体金免疫检测试纸条与德国拜法食品安全检测和饲料监控分析公司生产的莱克多巴胺ELISA检测试剂盒检测结果符合率均为100％;当样品中莱克多巴胺残留浓度>5ng/ml时，符合率可达85％以上。
　　 应用莱克多巴胺单克隆抗体免疫检测试剂检测了不同来源的样品。在江苏检验检疫局检测猪肉样品655份，莱克多巴胺ELISA试剂盒与LC-MSMS法对猪肉样品检测的符合率为100％。在吉林检验检疫局检测出口猪副产品31批次，莱克多巴胺未检出。国家质量安全监控计划部分2008年8-10月份检测进口冻猪副产品751批和盐渍肠衣69批，莱克多巴胺不合格率6.95％;2009年8-10月检测进口猪副产品869批，莱克多巴胺不合格率1.57％。

目录

文摘

英文文摘

符号说明

前言

第一章 莱克多巴胺及其检测研究进展

1 化学结构

2 理化特性

3 药理作用及机理

4 药物动力学

5 在动物组织中的代谢残留

6 毒性作用

7 检测技术和方法

7.1 色谱分析法

7.2 免疫分析法(IA)

参考文献

第二章 莱克多巴胺单克隆抗体的制备

1 材料与方法

1.1 实验动物和细胞

1.2 主要试剂及配制

1.3 主要仪器设备

1.4 器械及器皿

1.5 莱克多巴胺-蛋白质偶联物的制备

1.6 偶联物鉴定以及浓度测定

1.7 动物免疫

1.8 杂交瘤细胞的筛选和建株

1.9 单克隆抗体的制备

1.10 单抗50%抑制浓度(IC50)和特异性测定

2 结果

2.1 莱克多巴胺-蛋白质偶联物的鉴定

2.2 杂交瘤细胞的筛选和建株

2.3 单克隆抗体的亲和性和特异性

3 讨论

参考文献

第三章 莱克多巴胺ELISA检测试剂盒的研制

1 材料与方法

1.1 单克隆抗体

1.2 主要试剂及配制

1.3 主要仪器设备

1.4 器械及器皿

1.5 RCT-OVA偶联物的制备

1.6 间接竞争ELISA(ciELISA)条件的优化

1.7 间接竞争ELISA(ciELISA)操作程序和检测标准曲线的建立

1.8 试剂盒的组装

1.9 测试程序

1.10 试剂盒保存期试验

1.11 ELISA试剂盒标准检测曲线

1.12 尿、饲料、组织样品人工添加实验

1.13 复核实验

2 结果

2.1 ciELISA的试验条件

2.2 ciELISA标准检测曲线

2.3 试剂盒组装

2.4 ELISA 试剂盒的保存期

2.5 2.4 ELISA 试剂盒标准检测曲线

2.6 2.4 ELISA 试剂盒对模拟样品的检测

2.7 复核实验结果

3 讨论

附：莱克多巴胺酶联免疫反应检测试剂盒使用说明书

参考文献

第四章 检测莱克多巴胺胶体金免疫层析试纸条的研制

1 材料和方法

1.1 试剂和仪器

1.2 莱克多巴胺与OVA的偶联

1.3 莱克多巴胺单克隆抗体的胶体金标记

1.4 胶体金免疫层析试纸的制备

1.5 胶体金免疫层析试验的敏感性和特异性试验

1.6 模拟样品的检测

1.7 标准化检测试纸条的组装

1.8 保存期试验

1.9 复核试验

2 结果

2.1 单克隆抗体的提纯

2.2 胶体金免疫层析试验的敏感性和特异性

2.3 胶体金检测试纸条的组装

2.4 胶体金检测试纸条的保存期

2.5 胶体金免疫层析试纸的应用

2.6 复核实验结果

3 讨论

附：莱克多巴胺检测试纸条使用说明书

参考文献

第五章 莱克多巴胺单克隆抗体免疫检测试剂的应用

1 材料和方法

1.1 试剂和仪器

1.2 江苏检验检疫局对猪产品莱克多巴胺的检测

1.3 吉林检验检疫局对出口产品中莱克多巴胺和盐酸克伦特罗的检测

1.4 国家质量安全监控计划对进口猪肉产品莱克多巴胺的检测

2 结果与讨论

2.1 莱克多巴胺ELISA试剂盒在江苏检验检疫局的应用

2.2 莱克多巴胺ELISA试剂盒在吉林检验检疫局的应用

2.3 莱克多巴胺ELISA试剂盒在国家质量安全监控计划中的应用

全文总结

攻读博士学位期间发表的论文目录

致谢