昆虫病原菌菌株RG-1的分离鉴定及其杀虫毒素蛋白的分离纯化与活性研究

摘要

采用大蜡螟幼虫诱捕的方法从土样中诱捕昆虫病原微生物，对得到的昆虫病原微生物进行分离，经过纯培养后，再进行回复感染实验，得到了1株杀虫活性较强的昆虫病原细菌菌株RG-1。对菌株RG-1进行分类鉴定，结果表明，其生理生化性状与Serratia marcescens subsp.Sakuensis的比较吻合，只有2个性状不同，而与Serratianematodiphila有9个性状不同，与Serratia marcescens subsp.Marcescens也有8个性状不一样。16S rDNA同源性比对分析表明菌株RG-1与Serratia marcescens subsp.Sakuensis的16SrDNA的同源性最大为99.855％，与Serratia nematodiphila的同源性亦为99.855％，与Serratia marcescens subsp.Marcescens的同源性次之为99.566％。通过构建菌株RG-16S rDNA系统发育树，结合生理生化性状从而确定其为沙雷氏菌（Serratia）。
　　 菌株RG-1革兰氏染色反应呈阴性，菌体呈杆状，周身鞭毛；菌落颜色为红色或淡粉红色，圆形且平坦，边缘光滑，并且相互粘连，单菌落较难分开。菌株RG-1能利用葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、果糖、木糖、淀粉、甘露糖、纤维二糖、山梨糖、肌醇、卫芳醇、阿拉伯醇、侧盏金花醇、甘露醇、木糖醇、苦杏仁苷、胆汁七叶苷、七叶苷、鸟氨酸、粘液酸、尿素、葡萄糖酸盐、枸橼酸盐、N-乙酰葡萄糖胺、葡萄糖胺，不能利用乳糖、棉子糖、赤藓醇、丙酮酸钠、酒石酸盐、丙二酸盐、丙二酸盐、糊精。菌株RG-1氧化酶反应为阴性，接触酶反应为阳性，蛋白酶反应为阳性。实验测得其生长曲线符合一般细菌的生长规律；其在pH2至pH12的情况下都能生长，其最适生长pH为8.00；盐浓度耐受范围为1％-10％，最适生长盐浓度为1％。
　　 测定RG-1发酵液上清对大蜡螟初孵幼虫和老熟幼虫的毒力，当1 g人工饲料中添加100μg发酵液冻干粉时，其对初孵幼虫的校正死亡率为33.6％，168 h后体重抑制率为52.2％。向老熟幼虫血腔内注射20μL浓度为1.0μg·μL-1的发酵液冻干粉溶解液，其校正死亡率为93.3％。将昆虫病原细菌菌株RG-1的菌体细胞浓度稀释成如下梯度：107、106、105、104、103、102、101，注射大蜡螟老熟幼虫血腔内，测得其半数致死剂量为187.66个菌体细胞。发酵液上清液中的杀虫物质对蛋白酶K敏感，上清液蛋白酶K水解处理后杀虫活力下降很大，死亡率仅为31.1％；表明发酵液中杀虫活性主要组分为蛋白质。
　　 RG-1菌株胞外杀虫蛋白粗提物对大蜡螟初孵幼虫的胃毒毒力很高，当1 g人工饲料中添加100μg杀虫蛋白粗提物时，168 h后校正死亡率达到45.5％，生长抑制率也达到了75.2％。将杀虫蛋白粗提物溶解，并稀释到浓度为1.6μg·μL-1，用微量注射器将稀释好的杀虫蛋白粗提物10μL注射到大蜡螟的血腔内，24 h后大蜡螟校正死亡率为95.2％。表明菌株RG-1胞外杀虫活力比较强。
　　 RG-1胞外杀虫蛋白粗提物冻干粉经Sephadex G-75凝胶层析出现2个峰，分别命名为RGS-Ⅰ和RGS-Ⅱ。检测胃毒活力时，都按照1 g人工饲料中添加100μg冻干粉的比例分别添加RGS-Ⅰ和RGS-Ⅱ，RGS-Ⅰ校正死亡率为50.7％，168 h后体重抑制率为77.3％；RGS-Ⅱ校正死亡率为29％，体重抑制率为25.4％；该结果显示RGS-Ⅰ为胃毒力活性峰。检测血腔毒力时，向每头大蜡螟体内注射10μL浓度为1.6μg·μL-1杀虫蛋白冻干粉溶解液，RGS-Ⅰ的校正死亡率为94.1％，RGS-Ⅱ的校正死亡率为30.6％，表明RGS-Ⅰ为血腔毒力活性峰。
　　 将RGS-Ⅰ过DEAE Sepharose FF阴离子交换柱，得到2个峰，分别命名为RGD-Ⅰ和RGD-Ⅱ。检测胃毒活力时，都按照1 g人工饲料中添加100μg冻干粉的比例分别添加RGS-Ⅰ和RGS-Ⅱ，RGD-Ⅰ校正死亡率为27.9％，体重抑制率为24.2％，RGD-Ⅱ校正死亡率为55.6％，体重抑制率为78.2％，结果显RGD-Ⅱ为胃毒力活性峰。检测血腔毒力时，向每头大蜡螟体内注射10μL浓度为1.6μg·μL-1杀虫蛋白冻干粉溶解液，RGD-Ⅰ校正死亡率为28.3％，RGD-Ⅱ校正死亡率为91.7％，结果显示为RGD-Ⅱ为血腔毒力活性峰。
　　 非还原性SDS-PAGE图谱和还原性SDS-PAGE显示，杀虫蛋白经过分子筛和离子柱分离纯化后，在分子量50 kDa附近有一明显蛋白条带，表明该蛋白只有一个亚基。根据非还原性SDS-PAGE图谱计算该杀虫蛋白的相对分子质量约为52 kDa，命名为RG1P52。

目录

文摘

英文文摘

第一章 文献综述

1.昆虫病原细菌的研究进展

1.1 芽孢杆菌属

1.2 光杆菌属

1.3 致病杆菌属

2 杀虫毒素研究进展

2.1 细菌毒素

2.2 真菌毒素

3.研究目的和意义

参考文献

第二章 昆虫病原菌菌株RG-1的分离鉴定

1.材料与方法

1.1 大蜡螟来源

1.2 昆虫病原菌分离

1.3 回复感染实验

1.4 形态学鉴定

1.5 生理生化性状分析

1.6 其他生理生化性状的测定

1.7 分子生物学鉴定

2 结果与分析

2.1 菌株RG-1形态学观察

2.2 生理生化性状

2.3 pH耐受范围和最适pH

2.4 耐盐性检测和最适生长盐浓度

2.5 生长曲线

2.6 分子生物学鉴定结果

结论与讨论

参考文献

第三章 昆虫病细菌菌株RG-1的杀虫活性研究

1.材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果与分析

2.1 菌株RG-1菌体对大蜡螟老熟幼虫的毒力

2.2 菌株RG-1发酵液对大蜡螟初孵幼虫胃毒毒力

2.3 菌株RG-1发酵液对大蜡螟老熟幼虫的血腔毒力

2.4 不同培养时间发酵液的杀虫活性

2.5 蛋白酶K对发酵液杀虫活性的影响

结论与讨论

参考文献

第四章 昆虫病原菌菌株RG-1杀虫毒素蛋白的分离纯化及杀虫蛋白的毒力测定

1.材料与方法

1.1 材料

1.2 试剂

1.3 方法

2 结果与分析

2.1 杀虫蛋白粗提物对大蜡螟初孵幼虫的胃毒毒力测定

2.2 杀虫蛋白粗提物对大蜡螟老熟幼虫的血腔毒力检测

2.3 Sephadex G-75分子筛凝胶层析

2.4 DEAE Sepharose FF离子交换层析

2.5 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

2.6 胃毒毒力半数致死浓度

2.7 血腔毒力半数致死浓度

2.8 理化因素对杀虫蛋白杀虫活性的影响

结论与讨论

参考文献

全文结论

本文创新之处

攻读硕士学位期间发表的学术论文

致谢