共生菌Wolbachia和Cardinium对中国二斑叶螨和朱砂叶螨生殖的影响

摘要

朱砂叶螨Tetranychus cinnabarinus(Boisduval)和二斑叶螨T.urticae Koch属于蛛形纲Arachnida、蜱螨亚纲Acari、真螨目Acariformes、叶螨科Tetranychidae，是农林生产中十分重要的害螨。Wolbachia和Cardinium是广泛存在于节肢动物体内的两种共生细菌，均可通过宿主卵的细胞质进行母系遗传，并能通过不同的方法调控寄主的生殖以实现在宿主种群中的稳定存在和扩散.Wolbachia以诱导胞质不亲和（cytoplasmic incompatibility,CI）、诱导雌性化（feminization）、诱导孤雌生殖(parthenogenesis)和杀雄作用（male-killing）四种方式调控寄主的生殖，而Cardinium能够引起雌性化，诱导孤雌生殖，诱导胞质不亲和，影响宿主适合度和改变寄主的产卵行为。在我国，二斑叶螨仅感染共生菌Wolbachia，而朱砂叶螨中同时感染Wolbachia和Cardinium这两种共生菌。本文以中国二斑叶螨四个地理种群为实验材料，研究了共生菌Wolbachia对中国二斑叶螨生殖和适合度的影响以及影响Wolbachia调控寄主生殖的因子。本文以朱砂叶螨为实验材料，深入研究寄生菌Cardinium和Wolbachia对生殖和发育的共同调控作用，以及寄生菌之间的相互作用。本研究掌握了这两种寄生菌的感染进化规律和彼此的协同作用，明确了双重感染对叶螨生殖调控作用的机理，揭示了朱砂叶螨和二斑叶螨繁殖和发育的规律，并对利用这两种寄生菌有效控制朱砂叶螨、二斑叶螨和其它害虫的危害提供理论依据。
　　 为检验Wolbachia对中国二斑叶螨生殖的影响，根据中国区域的划分以及Wolbachia的感染情况，选择以二斑叶螨辽宁兴城(LN)、江苏徐州(JS)、上海闵行(SH)和湖南长沙(HN)四个地理种群为实验材料，通过孤雌回交和四环素处理分别筛选完全感染和完全不感染Wolbachia的品系后进行杂交实验。研究发现：上海闵行(SH)和湖南长沙（HN）体内的Wolbachia能诱导高强度的胞质不亲和(CI);辽宁兴城（LN淋内的Wolbachia不仅能诱导中等强度CI，而且能诱导杂交失败(Hybrid breakdown)；江苏徐州(JS)体内的Wolbachia既不能诱导CI，又不能诱导杂交失败。本研究第一次发现Wolbachia诱导的CI不仅表现为胚胎的大量死亡以及性比的偏离，还表现为后代在幼虫期的死亡。对于不亲和的杂交，CI的程度会随着回交有所增强。而感染Wolbachia的父本或母本杂交所产生的后代均具有生殖能力。此外还发现了一个有趣的现象，辽宁兴城种群感染Wolbachia的雌螨与不感染的雄螨交配（LNW/LNU）也会出现杂交失败现象。
　　 Wolbachia在不同中国二斑叶螨各种群中CI表达的差异较大。以二斑叶螨辽宁兴城(LN)、江苏徐州(JS)、上海闵行(SH)和湖南长沙（HN）四个地理种群为实验材料，研究Wolbachia株系、寄主遗传背景、雄虫年龄以及温度等因子对我国二斑叶螨体内Wolbachia诱导CI能力的影响。研究发现1、3、5、7日龄的雄螨诱导的CI的程度没有差异，表明雄螨日龄对我国二斑叶螨体内Wolbachia诱导CI的能力没有影响。二斑叶螨分别放在20℃的低温、25℃的适温和30℃的高温条件下饲养时，Wolbachia诱导CI的能力也没有任何变化，表明温度对我国二斑叶螨体内Wolbachia诱导CI的能力也没有影响。对我国二斑叶螨四个地理种群感染品系的线粒体DNACOI基因序列序列测定发现，四个地理种群的COI序列完全一致，Wolbachia降低了寄主的多态性，同时还表明四个地理种群的亲缘关系较近。对Wolbachia的wsp基因序列测定发现，四个地理种群感染的Wolbachia都属于B组Ori亚群。辽宁兴城、上海闵行和湖南长沙种群的Wolbachia的wsp基因序列相同，CI程度的差异主要是由寄主的遗传背景的差异造成的。而江苏徐州种群内Wolbachia与其他三个种群有99％的相似度，该种群中Wolbachia不能诱导CI则可能是Wolbachia株系与寄主的遗传背景共同作用的结果。
　　 Wolbachia对寄主的作用不仅表现在生殖调控上，对寄主的适合度也有一定的影响。Wolbachia与寄主之间的关系可以分为互利共生（mutualism）、单利共生(commensalism)和寄生的关系(parasitism).Wolbachia提高寄主适合度的同时能促进其种群中的扩散，相反Wolbachia降低寄主的适合度在某种程度上来说也会抑制其在种群间的扩散。本研究以二斑叶螨辽宁兴城(LN)、江苏徐州(JS)、上海闵行(SH)和湖南长沙（HN）四个地理种群为实验材料，研究Wolbachia对我国二斑叶螨各地理种群产卵量、性比、寿命以及发育历期的影响。研究结果表明Wolbachia对中国二斑叶螨适合度的影响既有利又有弊。本研究首次发现Wolbachia能增强二斑叶螨的产卵力，Wolbachia增强湖南长沙种群的产卵力，对其他种群却没有影响；Wolbachia提高江苏徐州种群的性比，对其他种群却没有影响；本研究是首次发现Wolbachia能影响二斑叶螨的寿命，Wolbachia延长江苏徐州种群的寿命却缩短辽宁兴城种群的寿命；Wolbachia延长江苏徐州和湖南长沙种群的发育历期，却缩短辽宁兴城和上海闵行种群的发育历期。我们认为，Wolbachia株系和寄主的遗传背景都对Wolbachia不同的表型起重要作用。
　　 对叶螨的研究发现，引起叶螨生殖隔离的机制主要有三种：核-核互作（nuclear-nuclear interaction）、胞质-核互作（nuclear-cytoplasmic interaction）以及Wolbachia引起的生殖不亲和。Wolbachia诱导胞质不亲和能促进生殖隔离的进化，从而被认为是能够促进节肢动物物种快速进化的一个重要因子。本研究以二斑叶螨辽宁兴城(LN)和江苏徐州(JS)两个地理种群为实验材料。研究我们二斑叶螨是否已经存在生殖隔离，Wolbachia是否会影响二斑叶螨种群间的生殖，并探讨Wolbachia能否影响我国二斑叶螨各地理种群间的基因交流。研究发现：目前我国二斑叶螨各地理种群间还没有出现核基因互作或胞质-核基因互作而造成的生殖隔离。Wolbachia能造成辽宁兴城与江苏徐州种群间的单向生殖隔离。辽宁兴城(LN)体内的Wolbachia在种群间不仅能诱导中等强度CI，而且能诱导杂交失败(Hybrid breakdown)，而江苏徐州(JS)体内的Wolbachia在种群间既不能诱导CI，又不能诱导杂交失败。辽宁兴城种群感染Wolbachia的雌螨与不感染的雄螨交配（LNW/JSU），江苏徐州感染Wolbachia的雌螨与不感染的雄螨交配（JSW/LNU）也均出现了杂交失败现象，我们推测Wolbachia在雌螨体内感染也能影响寄主的生殖。随着辽宁兴城Wolbachia感染率的上升，Wolbachia诱导的辽宁兴城与江苏徐州种群间的单向胞质不亲和会阻碍江苏徐州与辽宁兴城两个地理间的基因交流。
　　 Wolbachia和Cardinium都是能够诱导胞质不亲和(CI)的寄生菌。尽管Wolbachia和Cardinium感染同一寄主在自然界比较常见。我们对它们分别以及共同对寄主生殖影响的知之甚少。本研究以朱砂叶螨江芬镇江(JS)、云南玉龙（YN）和陕西西安(SN)种群为实验材料，研究Wolbachia和Cardinium分别以及共同对我国朱砂叶螨生殖和适合度的影响，雄螨日龄对Wolbachia和Cardinium诱导CI的影响。同时还通过遗传杂交和定量PCR研究Wolbachia和Cardinium的互作，探索Cardinium和Wolbachia是否存在竞争或协同互利共生的关系。通过青霉素G、四环素以及高温处理，我们成功的将Wolbachia和Cardinium从双感染品系中分离。对Wolbachia的wsp基因序列测定发现，江苏镇江和陕西西安种群的Wolbachia序列完全一致，属于B组的Con亚群，而云南玉龙种群属于B组Ori亚群。三个地理种群的Cardinium的相似度在97％-99％之间。杂交结果显示三个地理种群的双感染品系均能诱导CI，其中云南玉龙种群的CI程度最强。单感染Wolbachia在云南玉龙种群不能诱导CI，在其他两个种群诱导较弱的CI。对Cardinium的研究发现，江苏镇江和陕西西安种群的Cardinium诱导的高强度CI,CI程度与双感染品系间没有差异。而云南玉龙种群的Cardinium诱导中等强度的CI，并且CI的强度显著低于双感染品系，由此我们推测云南种群中的Wolbachia虽不能诱导CI，但可能对Cardinium有促进作用。对江苏镇江种群的深入研究发现，Wolbachia和Cardinium在江苏种群中彼此对生殖调控能力没有影响，对菌量既有促进又有抑制。本研究首次研究了雄螨日龄对Cardinium诱导的CI的程度的影响，结果发现雄螨日龄与Cardinium诱导的CI的程度成反比。雄螨日龄对Wolbachia诱导的CI没有影响。本研究还发现单感染和双感染品系都能提高寄主的寿命，而双感染品系还能缩短发育历期，从而提高寄主的适合度。

目录

文摘

英文文摘

第一章 文献综述

1 Wolbachia的研究进展

1.1 Wolbachia的形态与分布

1.2 Wolbachia的系统发育

1.3 Wolbachia的传播规律

1.4 Wolbachia对寄主生殖活动的调控

1.5 影响Wolbachia诱导的CI表达的因子

1.6 Wolbachia对寄主适合度的影响

1.7 Wolbachia的基因组学研究

2 Cardinium的研究进展

2.1 Cardinium的形态与分布

2.2 Cardinium的系统发育

2.3 Cardinium的传播规律

2.4 Cardinium寄主生殖活动的调控

2.5 Cardinium与Wolbachia共同感染

3 共生菌的生殖调控作用与应用

4 朱砂叶螨和二斑叶螨在我国的发生与危害

第二章 Wolbachia对中国二斑叶螨生殖的影响

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.2 二斑叶螨总DNA的提取

1.3 PCR检测二斑叶螨体内的Wolbachia

1.4 筛选100%感染和100%不感染Wolbachia的品系

1.5 遗传杂交

1.6 数据分析

2 结果

2.1 感染Wolbachia和不感染Wolbachia的品系筛选情况

2.2 Wolbachia对二斑叶螨生殖的影响

2.3 各地理种群内杂交各代间CI的比较

2.4 杂交失败(hybrid breakdown)的检测

3 讨论

第三章 影响Wolbachia诱导CI表达的因子

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.2 二斑叶螨总DNA的提取

1.3 PCR扩增

1.4 PCR产物纯化

1.5 质粒载体的连接反应和转化

1.6 质粒的提取

1.7 测序

1.8 杂交实验

2 结果

2.1 Wolbachia的wsp基因序列比较

2.2 四个二斑叶螨地理种群COI基因序列比较

2.3 雄螨日龄对CI的影响

2.4 温度对CI的影响

3 讨论

第四章 Wolbachia对二斑叶螨适合度的影响

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.2 产卵量和性比评估

1.3 寿命评估

1.4 发育历期评估

2 结果

2.1 Wolbachia对二斑叶螨产卵量的影响

2.2 Wolbachia对二斑叶螨性比的影响

2.3 Wolbachia对二斑叶螨寿命的影响

2.4 Wolbachia对二斑叶螨发育历期的影响

3 讨论

第五章 Wolbachia对中国二斑叶螨地理种群间生殖的影响

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.2 遗传杂交

1.3 数据分析

2 结果

2.1 Wolbachia诱导二斑叶螨种群间生殖隔离的检测

2.2 Wolbachia诱导二斑叶螨种群间杂交失败的检测

2.3 核基因互作以及胞质—核基因互作对种群间生殖的影响

2.4 二斑叶螨种群间杂交各代CI比较

3 讨论

第六章 Wolbachia和Cardinium分别以及共同对朱砂叶螨生殖的影响

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.2 朱砂叶螨总DNA的提取

1.3 PCR体系与序列测定

1.4 品系筛选

1.5 杂交实验

1.6 Wolbachia和Cardinium对寄主寿命的影响

1.7 Wolbachia与Cardinium共同对寄主发育历期的影响

1.8 实时定量PCR检测Wolbachia与Cardinium的菌量

2 结果

2.1 品系筛选

2.2 朱砂叶螨中细菌检测

2.3 Wolbachia的wsp基因序列比较

2.4 Cardinium的16SrDNA基因序列比较

2.5 单独感染Cardinium对朱砂叶螨生殖的影响

2.6 单独感染Wolbachia对朱砂叶螨生殖的影响

2.7 Cardinium与Wolbachia共同对朱砂叶螨生殖的影响

2.8 雄螨日龄对Cardinium与Wolbachia诱导CI的影响

2.9 Cardinium与Wolbachia对朱砂叶螨适合度的影响

2.10 Cardinium与Wolbachia间相互作用

3 讨论

参考文献

学术论文发表情况

致谢