类固醇激素合成酶及相关受体表达与猪卵泡闭锁过程的关系研究

摘要

卵泡发育过程中伴随着大量卵泡的退化，卵泡在到达排卵之前所发生的退化过程即卵泡闭锁（atresia）。卵泡闭锁是卵泡形成以后生殖细胞退化的主要方式，在所有的脊椎动物中都发现了卵泡闭锁现象，而且绝大多数卵泡都以闭锁的方式消失了。卵泡闭锁是多因素参与的复杂调控过程，动物实验已证实了某些因子的调控作用，但卵泡闭锁的机制仍有待于进一步的研究，其对控制人类生育、提高辅助生殖助孕技术的妊娠率、提高家畜繁殖率、阐明某些与排卵障碍有关疾病的机理都具有重要指导意义。本研究选用3-5mm直径的猪卵泡，首先通过外观判定，卵泡腔颗粒细胞计数以及卵泡液中孕酮、雌二醇比例的测定三种方法对其闭锁程度进行分类；然后检测了健康和早、晚期闭锁卵泡中一系列类固醇合成酶基因以及相关激素受体基因表达量的变化，分析了这些基因表达量彼此间，及其与卵泡生理指标变化间的相关性，分析了类固醇合成酶系统在有腔卵泡闭锁中的调控作用。研究结果如下：
　　 1、建立了判断猪卵泡闭锁程度的统一方法。
　　 本研究通过“外观判断+颗粒细胞密度+孕激素/雌激素比例”三个指标综合检测和判定分别处于健康、早期闭锁和晚期闭锁三阶段的卵泡。具体判断标准包括：1）外观标准：健康的卵泡呈清澈粉红色，卵丘卵母细胞复合体清晰可见，颗粒细胞层完整；早期闭锁卵泡呈较浑浊的暗橘黄色，卵丘卵母细胞复合体难以辨认，颗粒细胞层有破皱和部分脱落；晚期闭锁的卵泡呈浅浑浊的灰色，卵丘卵母细胞复合体脱落，颗粒细胞层严重脱落并沉积。2）颗粒细胞密度标准：健康组密度<2500个/μL；早期闭锁组密度在2500-10000个/μL间；晚期闭锁组密度>10000个/μL。3）激素比例标准：健康组P4/E2<5；早期闭锁组520。
　　 2、检测了猪卵泡闭锁过程中类固醇激素合成酶及相关受体的基因表达量变化。
　　 本实验提取了健康、早期闭锁和晚期闭锁三阶段猪卵泡总RNA，利用Real TimeRT-PCR对STAR、CYP11、CYP17、HSD3β、CYP19、FSHR、LHCGR、AR和PGR共9个基因的表达变化进行检测：1）STAR在健康组中表达量较高，随着闭锁程度加深逐渐降低；2）CYP11在健康组中表达量较低，随着闭锁程度加深逐渐升高，健康、早期闭锁两组与晚期闭锁组间差异显著；3）CYP17在健康组中表达量较高，随着闭锁程度加深逐渐降低；4）HSD3B在健康组中表达量较低，早期闭锁组中小幅下降，晚期闭组中升高；5）CYP19在健康组中表达量较高，随着闭锁程度加深逐渐降低，健康组与早、晚期两组闭锁的卵泡间差异显著；6）FSHR在健康组表达量较高，早期闭锁组骤降，晚期闭锁组有少量升高，健康组与早、晚期闭锁两组卵泡间差异显署；7）LHCGR在健康组中表达量较高，早期闭锁组降低，在晚期闭锁组有所升高；8）PGR在健康组中表达量较低，早期闭锁组有所下降，晚期闭锁组中忽然升高，健康、早期闭锁与晚期闭锁组间差异显著；9）AR在健康组中表达量较低，随着闭锁加深逐渐升高，健康、早期闭锁两组与晚期闭锁组间差异显著。
　　 3、阐明了猪卵泡闭锁过程中卵泡生理指标、类固醇激素合成酶及相关受体表达量间的相关关系。
　　 颗粒细胞密度与P、E含量比值的相关系数为0.438，呈显著正相关；与CYP19表达量的相关系数为-0.461，呈显著负相关；与CYP11的相关系数为0.690，呈极显著正相关。P含量与CYP11相关系数为0.467，呈了极显著正相关；与HSD3B的相关系数为0.539，呈极显著正相关；与FSHR的相关系数为-0.385，呈显著负相关；与PGR的相关系数为0.368，呈显著正相关；P含量与其他基因表达量无显著相关性。E含量与STAR表达量的相关系数为0.456，呈显著正相关；与CYP19的相关系数为0.446，呈显著正相关；与LHR的相关系数为0.684，呈极显著正相关；E与其他基因无显著相关性。STAR与LHR的相关系数为0.575，呈极显著正相关；CYP11与HSD3B的相关系数为0.386，呈显著正相关；与PGR的相关系数为0.525，呈极显著正相关：与AR的相关系数为0.369，呈显著正相关；HSD3B与PGR的相关系数、为0.706，呈极显著正相关；CYP19与FSHR的相关系数为0.361，呈显著正相关；与LHR的相关系数为0.434，呈显著正相关；AR与PGR的相关系数为0.575，呈极显著正相关；其他基因表达量间无显著相关性。
　　 4、分析了卵泡闭锁几种判定指标间的一致性
　　 外观判断的指标与颗粒细胞密度指标间有高度一致性；单一的雌二醇含量指标与卵泡外观判断的结果有显著相关性；单一的孕酮含量指标与卵泡外观判断的结果没有直接关系；P/E指标结合了孕酮和雌二醇两个因素，与卵泡外观判断的结果有显著相关性，起到了对单一孕酮和雌二醇因素的校正作用。

目录

文摘

英文文摘

基金项目

第一章 文献综述

1 哺乳动物的卵泡发育模式

1.1 原始卵泡库的形成

1.2 卵泡的募集

1.3 卵泡的发育

1.4 卵泡的选择和优势化

1.5 卵泡的成熟和排卵

1.6 卵泡闭锁与退化

2 卵泡发育的调控因子

2.1 下丘脑和垂体激素对卵泡发育的调节

2.2 卵巢类固醇激素对卵泡发育的调节

2.3 卵泡类固醇激素合成酶的分布和功能

2.4 垂体激素对类固醇激素合成的调控

2.5 生长因子对卵泡发育的调节

2.6 其他

3 卵泡闭锁调控机制研究进展

3.1 卵泡闭锁的概念及判定

3.2 生殖激素对卵泡闭锁的调控

3.3 细胞因子对卵泡闭锁的调控

3.4 卵泡闭锁的表观遗传学研究

4 研究内容以及目的意义

第二章 实验研究

1 实验材料

1.1 实验动物

1.2 试剂与仪器

1.3 主要生物学数据库和生物学软件

1.4 溶液配置

2 实验方法

2.1 卵泡的采集及卵泡液的分离

2.2 不同闭锁程度卵泡的判定

2.3 卵泡组织RNA的提取及检测

2.4 普通RT-PCR和产物检测回收

2.5 实时荧光定量（Real Time）PCR

2.6 数据统计分析

3 实验结果与分析

3.1 卵泡采集及闭锁程度的综合判定

3.2 猪卵泡组织RNA提取

3.3 目的基因的RT-PCR扩增结果

3.4 real-time PCR定量分析结果

3.5 卵泡生理指标、相关基因mRNA表达量间的相关性分析

3.6 卵泡闭锁几种判定指标间的一致性

4 讨论

4.1 影响试验成功的要素

4.2 猪有腔卵泡闭锁的分类方法

4.3 卵泡闭锁与各分类指标的统一关系

4.4 类固醇合成酶及相关激素受体对卵泡闭锁的影响

参考文献

全文结论

附 录

致 谢