转录因子Moap1及其相关基因在稻瘟病菌生长发育和致病中的功能分析

摘要

稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)是水稻生产上最具破坏性的病原菌之一,由其引起的稻瘟病严重威胁着全球水稻的生产安全。目前,对该病害的控制主要以选育和利用抗病品种为主,同时以化学农药防治为辅,但由于该病原菌易变,新的致病和抗药性群体的产生分别易导致新选育的抗病品种和药剂失去利用价值。因此,稻瘟病的防治始终是水稻生产上的一个重要难题,而控制该病害的重要前提是了解该病原菌的生长发育及致病分子调控机制。近年来,水稻和稻瘟菌全基因组测序工作的完成加速了稻瘟菌致病相关基因的发掘,同时也为从基因组水平上理解稻瘟病菌致病的分子机理提供了一个新的平台。本论文主要对转录因子Moapl及其相关基因在稻瘟菌生长发育及致病中的相关功能进行了系统的研究,结果如下:
　　 本文从稻瘟病菌全基因组数据库中鉴定了一个与粟酒裂殖酵母转录因子PAP1高度同源的bZIP转录因子Moapl,该转录因子具有YAP1转录因子的典型结构域,并可互补酿酒酵母yapl缺失突变体对过氧化氢的敏感性。Moapl的敲除对稻瘟病菌生长速率没有明显影响,但是导致其对过氧化氢耐受性降低、胞外漆酶和过氧化物酶活性显著下降；同时该基因的敲除使稻瘟菌分生孢子形成能力显著降低,且突变体产生的分生孢子形态发生改变；突变体分生孢子及其附着胞中活性氧(Reactive oxygenspecies,ROS)积累增加；该突变体的附着胞可穿透洋葱表皮细胞,但是不能正常扩展；该突变体丧失了对水稻敏感品种CO-39的致病性。进一步对突变体进行RNA—SEQ分析,发现有1200个基因的表达量不同程度地发生改变,51个参与氧化还原反应的基因在突变体体中下调表达,3个漆酶及14个胞外过氧化物酶基因的转录较野生型菌株显著下降；稻瘟菌中参与产孢梗形成的基因COS1在突变体中显著下调表达,同时,在突变体中,致病性相关基因MPG1较野生型菌株亦显著下调表达。
　　 从稻瘟病菌Moapl突变体转录组数据中获得了一个显著下调表达(4.7倍)的SSADH酶编码基因-Mossadh,该基因全长1611 bp,含有两个内含子,其编码的蛋白含536个氨基酸。该基因敲除导致生长速率显著下降、对外源的H2O2胁迫敏感,突变体胞外漆酶和过氧化物酶活性显著降低；突变体在CM和产孢培养基上生长均不能产气生菌丝；Mossadh缺失突变体不产分生孢子；该突变体丧失对水稻和大麦的侵染能力,进一步试验观察到突变体菌丝在洋葱表皮细胞上形成附着胞的能力较野生型菌株显著降低,且其附着胞丧失了穿透洋葱表皮细胞壁的能力。
　　 根据稻瘟菌Moapl突变体转录组数据库,从中发现一个下调表达的乙酰基转移酶编码基因Moact。它编码一个含271个氨基酸的蛋白质。该基因敲除后导致生长速率显著降低,同时对外源的H2O2胁迫表现敏感；敲除突变体胞外漆酶和过氧化物酶活性活显著下降；突变体在CM和产孢培养基上均不产气生菌丝,也不产生分生孢子。使用突变体菌丝块创伤和无创伤接种水稻叶片,均不能引起水稻叶片发病。进一步在洋葱表皮上测定了突变体菌丝的穿透能力,发现突变体菌丝在洋葱表皮细胞上形成附着胞的能力较野生型菌株显著降低,且形成的附着胞不能穿透洋葱细胞壁；突变体注射接种可在水稻叶片上形成很小且不能扩展的坏死斑。上述结果表明,Moact参与调控稻瘟病菌的侵入及侵入后侵染菌丝的扩展,从而控制稻瘟病菌对水稻的致病性。
　　 从稻瘟病菌Moapl突变体转录组数据库中发现一个与粟酒裂殖酵母bZIP转录因子ATF/CREB高度同源且转录明显上调的基因Moatfl,并对其生物学功能进行研究。与野生型菌株相比,Moatfl敲除突变体生长速率显著降低,对过氧化氢表现敏感；突变体降低了对水稻敏感品种CO-39的致病性。突变体分生孢子接种水稻叶鞘72 h后,其多数侵染菌丝生长畸形,并不能在初始侵染的细胞中扩展,且水稻被突变体侵染后其体内防卫相关基因转录明显上调,DAB染色观察到被突变体侵染的水稻叶鞘细胞及突变体附着胞周围的叶鞘细胞均积累了大量H2O2,而野生型菌株侵染时却未发现类似的现象,表明突变体可激活水稻的防卫反应.而采用ROS产生的特异性抑制剂DPI抑制水稻叶鞘细胞产生ROS后,突变体形成的侵染菌丝在叶鞘细胞中可以恢复扩展；突变体胞外漆酶和过氧化物酶活性显著下调,Real-time PCR检测到突变体胞外漆酶和过氧化物酶基因的转录量较野生型菌株显著下降,但由于突变体对外源盐胁迫和细胞壁胁迫没有变化,表明Moatfl突变体侵染菌丝在水稻细胞内扩展受阻是其诱发积累的ROS引起的,而不是突变体对外界的胁迫耐受性降低产生的。上述结果提示,稻瘟菌转录因子Moatfl可能通过调控过氧化物酶和漆酶的转录来消除水稻的ROS,从而抑制其防卫反应,最终达到致病的目的。
　　 综上所述,转录因子Moapl是稻瘟病菌一个重要的调控因子,通过调控一系列基因的转录变化从而调控稻瘟病菌的生长发育及其对水稻的致病性。