Isoptericola jiangsuensis sp.nov.的分离、鉴定及其几丁质酶基因的克隆与表达

摘要

几丁质(chitin)是由N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖(GlcNAc)以β-1,4糖苷键连接而成的直链多糖,在天然多聚物中的储量仅次于纤维素。几丁质和几丁质酶在食品、医学、化工、农业和环境保护等方面都具有广阔的应用前景,因而其研究、利用一直都是生命科学领域中的重大课题。
　　 从采自江苏、福建和浙江的7份土样中分离出96株能产几丁质酶的菌株,经几丁质酶活测定复筛出23株酶活较高的菌株。通过形态学、生理生化鉴定和基于16SrRNA基因序列的系统发育分析,将其归类为9个属,从中选择了产酶活力相对较高且尚未报道的Isoptericola sp.CLG菌株作为本论文的研究菌株。
　　 采用形态学特征,生理生化性状测定、细胞肽聚糖型、细胞壁单糖组分、磷脂组成、全细胞脂肪酸分析等化学分类方法以及DNA G+C mol％含量测定、DNA-DNA同源性比较和16s rRNA基因序列比较等分子生物学方法对菌株CLG的分类地位进行了研究。CLG菌体革兰氏染色阳性、球状或短杆状,不运动、无孢子。在MMC培养基上菌落呈圆形、橘黄色、边缘整齐平滑,表面光滑并凸起。生长温度范围为10-42℃(最适生长温度为30℃),酸度生长范围为pH5.0-10.5(最适生长pH为7.0)。菌体能够生长于0-10％NaCl浓度的培养基中(最适生长NaCl浓度为2％)。菌株CLG不产吲哚和H2S,但能产氨,VP、MR反应和氧化酶反应阴性。细胞壁肽聚糖型为L-Lys—D-Asp,细胞壁单糖主要组分为半乳糖,少量的鼠李糖和木糖。细胞主要脂肪酸(>10％)为ameiso-C15:0和iso-C15:0,含有的磷脂为双磷脂酰甘油(DPG)、磷脂酰甘油(PG),磷脂(PL)、磷脂酰肌醇(PI)、3种磷脂酰糖脂(PGL)和一种未知脂类。菌株CLG基因组DNA的G+C摩尔百分含量为70.3,与I.dokdonensis DS-3T的DNA杂交同源性为58.7％。根据这些特征,最终确定菌株CLG为Isoptericola属的一个新种,命名为江苏白蚁菌Isoptericola jiangsuensis sp.nov.。
　　 酶的定域实验表明,该菌株的几丁质酶为胞外酶,而且为诱导酶。此外,还测定了培养基初始pH、培养温度、装液量、培养时间、碳氮源种类及其浓度等单因子对菌株CLG产几丁质酶的影响。并在此基础上通过正交实验优化了发酵培养基的配方,优化后的培养基配方为:细粉几丁质0.75％(w/v),(NH4)2SO40.1％(w/v),KH2PO40.05％(w/v),NaCl0.05％(w/v),K2HPO40.15％(w/v),MgSO40.002％(w/v)。在该条件下,几丁质酶活达到1.972 U/mL,比在原培养基和培养条件下的酶活力提高了1.2倍。
　　 利用几丁质酶编码基因的特异性引物从CLG基因组DNA中扩增出了一段274bp的几丁质酶基因的保守片段(chiA-CF)。在此基础上,利用SEFA-PCR获得长为5233bp的DNA片段,序列分析显示该DNA片段上存在2个相连的开放阅读框ORF1和ORF2。序列同源性比较发现ORF1和ORF2分别为几丁质酶基因chiA和chiB。其中,chiA由2616个核苷酸组成,编码871个氨基酸(aa),将其编码的几丁质酶命名为Is-chiA；chiB由1686个核苷酸组成,编码561个aa,将其编码的几丁质酶命名为Is-chiB。Is-chiA由一个信号肽、两个typeⅢ型几丁质结合域和一个18家族糖苷酶催化结构域组成；而几丁质酶Is-chiB则由一个信号肽和一个18家族糖苷酶催化结构域组成。Is-chiA和Is-chiB与Arthrobacter sp.TAD20的几丁质酶ArChiA和ArChiB分别显示出了58％和62％的同源性。将chiA、chiB两个基因分别克隆到pET-28a(+)载体上构建重组质粒p28-chiA和p28-chiB,转入E.coli BL21(DE3)进行诱导表达,诱导后经SDS-PAGE分析,可见分子量约为92 kDa和60 kDa的蛋白Is-chiA和Is-chiB。Is-chiA和Is-chiB分别具有外切型几丁二糖酶和内切几丁质酶的活性,两者均无N-乙酰葡萄糖胺酶活性。通过镍柱对Is-chiA和Is-chiB进行了纯化,并对两者的酶学特性进行了研究。Is-chiA最适反应温度为30℃,其在40℃以下范围内较稳定,最适反应pH值为5.0,在pH4.5-8.0的条件下比较稳定,Ca2+、Ba2+、Zn2+(0.1mM-10mM)对其有激活作用,Ni+(0.1 mM-10mM)影响不大,Mg2+,Li+,Mn2+,Cu2+,Co2+,Fe3+,Cr3+,Pb2+,Cd2+(0.1 mM-10 mM)则对其均有一定的抑制作用,EDTA存在时,Is-chiA的酶活稍有增加。Is—chiA对底物4-MU-(NAG)2的Km为6.79μg·-mL-1(11.66μmol·L-1),Vmax为10.93μmol·min-1·mg-1。Is-chiB最适反应温度为50℃,在30℃以下范围内较稳定,最适反应pH值为9.0,在pH7.0-10.0的条件下较稳定,除Co2+和Cr3+外,其它各种浓度(0.1 mM-10 mM)的试验金属离子对Is-chiB均有激活作用,当EDTA存在时,酶活稍有下降。Is-chiB对底物4-MU-(NAG)3的Km为13.38μg·mL-1(17μmol·L-1),Vmax为12.24μmol·min-1·mg-1。
　　 此外,还尝试将chiA和chiB基因克隆到pPIC9K载体上,经BglⅡ内切酶线性化后转入P.pastoris GS115中诱导表达。但它们在P.pastoris GS115中未能表达,这或许是由于这2个基因的G+C含量过高或稀有密码子偏多的缘故。