青虾分子标记的开发应用及遗传连锁图谱的构建

摘要

青虾,学名日本沼虾(Macrobrachium,nipponense),隶属十足目(Decapoda),长臂虾科(Palaemonidae)、沼虾属(Macrobrachium),广泛分布于全国各地。青虾养殖年产量约20.5万吨,养殖年产值近100亿元,是我国重要的淡水养殖虾类.我国青虾养殖规模大、发展快、潜力大,但近年来普遍出现了品种退化现象,而相应的遗传育种研究工作起步很晚且相对落后,离产业发展需求还有较大距离.因此,加强青虾遗传背景研究,建立起适合于青虾的育种技术,培育青虾优良品种显得尤为重要。为此,本文拟开展如下三个方面的研究:
　　 1.青虾微卫星标记的开发与筛选
　　 微卫星标记由于其具有多态性好、共显性遗传等特点,在遗传学和遗传育种研究中备受青睐.已报道的青虾微卫星标记数量很少,不能满足青虾遗传学研究的需要。本文采用FIASCO(fast isolation by AFLP ofsequences containing repeats)方法构建了青虾基因组富集文库((GT)n+(AG)n),测序140个克隆,舍有重复次数5次以上的微卫星序列克隆123个,阳性率达到87.8％；其中,完美型微卫星序列共有82个,占66.7％；非完美型的25个,占20.3％；复合型的16个,占13.0％.采用Primer Premier5.0共设计出75对微卫星引物,其中共有54对引物能够扩增出目的产物,具有多态性的共有28对引物.将此28个微卫星序列连同本实验室之前开发的12个具有多态性微卫星序列整理编号,共40个位点已登录GenBank(注册号:GU189600—GU189639)。
　　 采用野生太湖青虾群体(THW)和野生太湖青虾在池塘养殖的第三代(TH3)进行多态性的比较分析,40个位点在两个青虾群体中均呈多态性,等位基因数量为2-10个,多态信息含量PIC值从0.186到0.900不等,其中高度多态位点31个(PIC>0.5),中度多态位点8个(0.25　　 2.长江不同江段青虾遗传多样性研究
　　 长江是青虾的优良种质资源库,也是我国青虾养殖的重要亲本库,长江野生青虾种质资源状况的研究对于青虾种质资源保护和科学利用均具有重要意义。本文采用20个微卫星分子标记对长江不同江段共6个青虾群体进行了遗传多样性分析,采样点包括重庆、万州、宜昌、武汉、九江和江阴。结果表明:6个青虾群体平均等位基因数(A)为5.25,平均有效等位基因数(Ne)为3.4622；20个位点平均多态信息含量PIC为0.5894；6个群体期望杂合度平均值为0.6296,表明长江青虾遗传多样性丰富；期望杂合度由高到低依次为:江阴群体(0.6308)、九江群体(0.6096)、宜昌群体(0.5945)、武汉群体(0.5934)、万州群体(0.5844)、重庆群体(0.5821)。分子方差分析(AMOVA)结果表明长江青虾6群体间遗传变异6.92％来自群体间,93.08％来自群体内部,两两群体间Fst值在0.0253—0.0838之间,表明群体间已明显出现分化(P<0.05),但分化程度中等.Hardy-Weinberg平衡检验表明,6群体均出现杂合子缺失现象,可能是由于稀有等位基因缺失或无效等位基因造成；6群体间遗传距离在0.0620-0.1809之间,UPGMA聚类分析表明,江阴群体单独聚为一类,其余5个群体聚为另一类,其中九江和武汉群体最先聚到一起,其次万州、宜昌和重庆群体聚为一类.
　　 3.利用微卫星和SRAP标记构建青虾遗传连锁图谱
　　 遗传连锁图谱是具有重要价值的遗传背景资料,而青虾作为我国重要的淡水养殖品种,尚未见遗传连锁图谱构建方面的报道.本文采用微卫星和SRAP标记构建青虾的遗传连锁图谱.共采用青虾微卫星位点136个,其中40个来自本文第一章,其余均由Genbank下载青虾微卫星序列设计获得.经筛选,有52个位点在亲本中表现分离。共有38个位点在亲本和作图群体中呈现孟德尔分离,其中母本标记有11个,占分离标记总数的28.9％；父本标记有10个,占分离标记总数的26.3％；剩余44.7％的标记为双亲共有标记.100对SRAP引物组合共扩增出2724条片段,平均每个引物组合扩增出27.2个片段.其中有493个条带在父母本中呈现多态,平均每个引物组合产生4.9个多态标记.344个多态标记符合孟德尔分离,其中309个标记符合1:1分离,母本标记132个占多态标记总数的38.4％；父本标记177个,占多态标记总数的51.4％.
　　 将符合孟德尔分离的38个微卫星标记和符合1:1分离的309个SRAP标记进行连锁分析,构建青虾的遗传连锁图谱。共有175个标记(含25个微卫星、150个SRAP标记)分布在53个连锁群上。每个连锁群含2-8个标记,其中不少于3个标记的连锁群有35个,连锁对18个,平均每个连锁群的标记数为3.3个；连锁群长度在6.7-91.2cM之间,15号连锁群的平均间隔最大,为30.4 cM,36号连锁群的平均间隔最小,仅为6.7 cM。青虾框架图谱长度为997.2 cM；青虾连锁图谱观察总长度为2270.5 cM,平均间隔为13.1 cM；根据估算,青虾遗传连锁图谱预期长度为4380.6 cM,图谱的覆盖率51.83％。
　　 本文开发了青虾微卫星位点,为青虾遗传学研究提供了新的分子标记；对长江不同江段野生青虾种质状况和遗传多样性进行了研究,积累了青虾遗传背景资料,可为长江青虾资源的保护和科学利用提供指导；构建了第一张青虾遗传连锁图谱,可为青虾QTL定位、基因克隆、分子标记辅助育种等提供参考,并为进一步构建高密度的遗传连锁图谱奠定了基础。