禽流感H9N2灭活抗原饮水免疫对鸭消化道局部和全身免疫水平的影响

摘要

应用鸭源禽流感H9N2灭活抗原配合黏膜免疫佐剂CpG DNA(以下简称CpG)和葡萄糖饮水免疫,研究鸭消化道局部(主要是咽和小肠)和全身免疫水平的变化。7日龄雏鸭125只随机分为5组.10日龄时,第1组应用0.3 ml生理盐水饮水；第2组应用0.3 ml鸭源禽流感H9N2灭活抗原饮水免疫；第3组应用0.3 ml鸭源禽流感H9N2灭活抗原配合葡萄糖饮水免疫；第4组应用0.3 ml鸭源禽流感H9N2灭活抗原配合CpG饮水免疫；第5组应用0.3ml鸭源禽流感H9N2灭活抗原配合CpG和葡萄糖饮水免疫。14日龄时再进行二次免疫。首次免疫后第3、5、7周宰杀动物并取材。首先,通过检测消化道中上皮内淋巴细胞(IEL)、肥大细胞数量和小肠黏膜细胞因子IL-2和IL-6水平来探讨禽流感H9N2灭活抗原配合佐剂饮水免疫对鸭消化道局部细胞免疫的影响；通过检测消化道IgA和IgC分泌细胞数量及特异性抗体水平来探讨禽流感H9N2灭活抗原配合佐剂饮水免疫对消化道局部体液免疫的影响；然后,通过检测血清中特IgA和IgG抗体及禽流感HI抗体水平来探讨禽流感H9N2灭活抗原配合佐剂饮水免疫对全身免疫水平的影响；最后,通过攻毒试验来验证禽流感H9N2灭活抗原配合佐剂饮水免疫后,鸭群对H9N2病毒攻击的抵抗力及免疫对鸭从粪便中排出病毒的影响；通过混合感染试验来探讨禽流感H9N2灭活抗原配合佐剂饮水免疫对混合感染的影响.结果如下:
　　 1.鸭IgA和IgG的提纯和兔抗鸭IgA和IgG高免血清的制备
　　 本试验首先从胆汁和血清中分别提纯鸭的IgA和IgG,然后通过Sephadex G200凝胶过滤和DEAE-SephadexA-52纤维素柱；最后经SDS-PAGE电泳鉴定结果显示,IgA and IgG的重链分子量分别为70000～72000和67000.轻链分子量相同,约为26
　　 000.纯化的鸭IgA和IgG分别背部皮下接种兔,所得的抗血清经双向琼扩试验测定其效价,证明兔抗鸭IgA和IgG血清中抗体水平均达到1:32.
　　 2.禽流感H9N2灭活抗原饮水免疫对鸭消化道局部细胞免疫水平的影响
　　 应用HE染色法显示小肠上皮内淋巴细胞,结果发现:应用CpG或应用CDG和葡萄糖配合禽流感H9N2灭活抗原饮水免疫雏鸭后小肠中IEL数量显著增多(P<0.05)；单独应用或用葡萄糖配合禽流感H9N2灭活抗原饮水免疫后IEL数量均无明显变化.
　　 应用甲苯胺蓝染色法显示咽和小肠中肥大细胞,结果发现:应用CpG或应用CoG和葡萄糖配合禽流感H9N2灭活抗原饮水免疫雏鸭后,咽和小肠中肥大细胞数量显著或极显著增加(P<0.05或P<0.01)；而单独应用或用葡萄糖配合禽流感H9N2灭活抗原饮水免疫后肥大细胞数量均无明显变化。
　　 应用放射免疫法测定小肠黏膜中细胞因子IL-2和IL-6的水平,结果发现:应用CpG或应用cpG和葡萄糖配合禽流感H9N2灭活抗原饮水免疫鸭在免疫后小肠黏膜中IL-2和IL-6水平均极显著增加(P<0.01)；而单独应用或应用葡萄糖配合禽流感H9N2灭活抗原饮水免疫的鸭IL-2和IL-6水平均无明显变化。
　　 以上三个试验结果表明,禽流感H9N2灭活抗原配合佐剂饮水免疫可有效诱导鸭消化道局部细胞免疫应答。
　　 3.禽流感H9N2灭活抗原饮水免疫对鸭消化道局部体液免疫水平的影响
　　 应用SPA-HRP间接染色法显示咽和小肠中IgA和IgG分泌细胞,结果发现:应用CpG或应用CpG和葡萄糖配合禽流感H9N2灭活抗原饮水免疫雏鸭后咽和小肠中IgA和IgG分泌细胞面积显著或极显著增加(P<0.05或P<0.01)；而单独应用或应用葡萄糖配合禽流感H9N2灭活抗原饮水免疫后小肠IgA和IgG分泌细胞面积均无明显变化。
　　 应用间接ELISA方法检测咽和小肠黏膜部位SIgA和IgG抗体水平,结果表明:应用CpG或应用CpG和葡萄糖配合禽流感H9N2灭活抗原饮水免疫后,鸭的咽和小肠中SIgA和IgG抗体水平极显著增加(P<0.01)；而单独应用或应用葡萄糖配合禽流感H9N2灭活抗原饮水免疫的鸭SIgA和IgG抗体水平无明显变化。
　　 以上两个试验结果表明,禽流感H9N2灭活抗原配合佐剂饮水免疫可诱导鸭消化道局部体液免疫应答。
　　 4.禽流感H9N2灭活抗原饮水免疫对鸭全身免疫水平的影响
　　 应用血凝抑制(HI)试验检测血清中禽流感HI抗体水平,结果表明:首免后第3、5、6周,应用CpG或应用CpG和葡萄糖配合禽流感H9N2灭活抗原饮水免疫鸭血清中禽流感HI抗体水平显著升高(p<0.05)；而单独应用或应用葡萄糖配合禽流感H9N2灭活抗原饮水免疫的鸭血清中禽流感HI抗体水平无明显变化。
　　 应用间接ELISA方法检测血清中禽流感特异性IgA和IgG抗体水平,结果表明:应用CpG或应用CpG和葡萄糖配合禽流感H9N2灭活抗原饮水免疫显著提高了血清中禽流感特异性IgA(首免后2至6周)和IgG(首免后3至7周)抗体水平(P<0.05)；而单独应用或用葡萄糖配合禽流感H9N2灭活抗原饮水免疫对鸭血清中禽流感特异性IgA和IgG抗体水平无明显变化。
　　 以上两个指标提示,禽流感灭活抗原配合佐剂饮水免疫能够在一定程度上诱导全身免疫水平。
　　 5.禽流感H9N2灭活抗原饮水免疫对鸭攻毒保护和病毒扩散的影响
　　 攻毒试验7日龄鸭30只随机分为3组。第1组应用生理盐水饮水；第2组应用禽流感H9N2灭活抗原饮水免疫；第3组应用禽流感H9N2灭活抗原配合CpG和葡萄糖饮水免疫。首次免疫后第21天用禽流感H9N2病毒(ELD50为108·32/0.1ml)口腔滴注攻击,剂量为每只鸭2ml.攻毒后各组鸭均无临床症状,剖检时也无肉眼可见损伤。病毒分离结果发现:攻毒后第3天,应用生理盐水和单独应用禽流感H9N2灭活抗原饮水免疫组有部分鸭的样品中分离到禽流感病毒,而未从应用禽流感H9N2灭活抗原配合CpG和葡萄糖饮水免疫鸭体内分离到病毒。结果提示应用禽流感H9N2灭活抗原配合CpG和葡萄糖饮水免疫后,鸭群能够在一定程度上抵抗H9N2病毒的攻击。
　　 病毒扩散试验7日龄鸭24只,其中12只雏鸭应用生理盐水饮水,另12只雏鸭应用鸭源禽流感H9N2灭活抗原配合CpG和葡萄糖饮水免疫,首次免疫后第21天分别取6只鸭用禽流感H9N2亚型病毒口腔滴注攻击。攻毒后混合饲养。病毒分离结果显示,分别与未免疫攻毒鸭和免疫后攻毒鸭混合饲养后,未免疫鸭的病毒分离阳性鸭数要高于免疫鸭。结果表明,应用禽流感H9N2灭活抗原配合CpG和葡萄糖饮水免疫后能减少病毒扩散。