江苏地区大宗淡水鱼养殖池塘气单胞菌分离、鉴定和遗传多样性研究

摘要

本研究通过RS选择性培养基,从采集自江苏大宗淡水鱼养殖池塘的未发病池塘和发病池塘的样品中共分离到182株细菌。氧化酶、触酶和O/F实验分析显示,其中152株为疑似气单胞菌。
　　 运用16S rRNA通用引物测得实验菌株的16S rRNA的部分序列,在GenBank数据库中用NCBI-BLAST软件进行同源性检索,结果显示152株实验菌株中有89株为气单胞菌属,其中有63株可鉴定到种的水平(63/89,70.8％)。再运用相同方法根据气单胞菌的gyrB基因对剩下的26株用16S rRNA序列无法鉴定至种的菌株进行鉴定。结果发现,不管是在正常养殖塘口中还是在发病池塘中,以维氏气单胞菌(Aeromonasveronii)分布最广泛、数量最多(未发病池塘菌株:31/37,83.8％；发病池塘菌株:39/52,75％),而嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)分布不广泛、数量也较少(未发病池塘菌株:1/37,2.7％；发病池塘菌株:10/52,19.2％)。除此之外,还分离出少量的杀鲑气单胞(Aeromonas salmonicida)、中间气单胞菌(Aeromonas media)和简达气单胞菌(Aeromonas jandaei)。
　　 利用PCR法检测89株气单胞菌气溶素(aer)、溶血素(hly)和细胞兴奋性肠毒素(alt)三种毒力基因,结果发现,89株气单胞菌中含有气溶素基因的有20株,占气单胞菌总数的22.5％；含有溶血素基因的有34株,占气单胞菌总数的38.2％；含有细胞兴奋性肠毒素基因的有34株,占气单胞菌总数的38.2％。其中37株环境菌株中有9株未扩出这3种毒力基因的目的条带,其余28株致病性气单胞菌均扩增出数量不等的毒力基因条带。28株环境菌株的毒力基因型主要以2种及以上的基因型组合为主。52株病原菌株中有19株未扩增出这3株毒力基因的目的条带,其余33株致病性气单胞菌均扩增出数量不等的毒力基因条带。33株病原菌株的毒力基因型组合无明显规律。
　　 由于A.veronii在大宗淡水鱼养殖池塘中分布广泛,因此利用A.veronii的16s rRNA序列和管家基因序列对其进行遗传多样性分析。从基于16S rRNA基因序列的NJ系统发育树上可知,常州地区未发病池塘和发病池塘分离得到的A.veronii可分为两大遗传类群,在第一类群中,共有30株A.veronii,第二类群中共有14株A.veronii,未发病池塘和发病池塘的A.veronii交错分布在系统发育树上。常州、无锡和盐城三个地区不同发病池塘分离得到的A.veronii主要分为三大遗传类群,第一类群中共有20株A.veronii,其中常州地区分离得到的有11株,无锡地区的有8株,盐城地区的有1株；在第二类群中共有11株A.veronii,其中常州地区分离得到的有6株,无锡地区的有4株,盐城地区的有1株；在第三类群中共有7株A.veronii,其中常州地区分离得到的有4株,无锡地区的有2株,盐城地区的有1株,三大遗传类群中A.veronii多是相同地区的聚在一起。从基于联合16s rRNA、gyrB和dna.J基因序列的NJ系统发育树上可知,常州地区未发病池塘和发病池塘分离得到的A.veronii可分为四大遗传类群,第一类群中共有18株A.veronii,其中未发病池塘中分离的有10株,发病池塘中分离的有8株；第二类群中共有15株A.veronii,其中未发病池塘中分离的有11株,发病池塘中分离的有4株；在第三类群中共有6株A.veronii,2株为未发病池塘水体分离,1株为健康团头鲂肠道内容物分离的,3株为发病池塘鱼体分离的；第四类群中,健康团头鲂肠道IA0804与病样FA0903,健康团头鲂肠道IA0815与水样WA0916分别聚类。不同地区发病池塘分离得到的A.veronii分为两大遗传类群,第一类群中共有22株A.veronii,其中常州地区分离得到的有12株,无锡地区的有10株；在第二类群共有16株A.veronii,其中常州地区分离得到的有9株,无锡地区的有4株,而盐城地区发病池塘分离的有3株,不同地区发病池塘分离得到的A.veronii大多数能够按照地域聚在一起。