甘蓝型油菜2个细胞质雄性不育系的线粒体基因组研究

摘要

细胞质雄性不育是主要杂种优势利用工具，作为一种天然存在的败育现象，细胞质雄性不育系也是植物遗传学研究的基础材料，因此深受植物学家的重视．大量研究已表明细胞质雄性不育的发生与线粒体基因组的结构变异有关。Pol型细胞质雄性不育是世界上应用最广泛的油菜细胞质雄性不育胞质。本研究对包括Pol细胞质在内的两个细胞质雄性不育系进行线粒体基因组测序；通过线粒体基因组序列相比较，研究了油菜线粒体基因组的结构；进一步，研究了油菜线粒体基因组构成。主要研究结果如下：
　　 1．Pol CMS系NH12A的线粒体基因组研究
　　 ①NH12A线粒体基因组测序与基因鉴定：NH12A是Pol胞质不育系，本研究采用shotgun测序技术，完成了其线粒体基因组测序。从shotgun文库中随机挑选白斑茵落测序，得到了2592条序列，覆盖率超过11倍；进一步，用Phred-Phrap软件拼接，得到5个contig;再周PCR方法，补齐缺口，得到一个完整环状线粒体DNA，全长为223412 bp。为区别于前人所测定的序列，将此序列称为pol型(pol mitotype)，将前人的Nap胞质线粒体基因组序列称为nap型．pol型含34个编码蛋白的基因、3个核糖体RNA基因和18个tRNA基因，编码基因序列总长38742 bp，占整个基因组17.34％。与nap型比较，pol型的已知功能基因中，48个基因与nap型完全相同，但pol型中多1个trnH基因，其余6个基因有差异，分别是：coxl、cox2、atpl、trnC、trnE和orf224．除orf224差异较大外，其他5个基因均仅有1个核苷酸差异，且不影响功能。该序列鉴定得到了44个未知功能的ORF，其中35个ORF与nap型完全相同，其他ORF有差异，其中orf122和orf132为pol型特有序列，而orf117b则为nap型独有序列．
　　 ②比较基因组分析：pol型与nap型序列基因组的核苷酸序列高度保守，但是序列发生了至少5次重排，与CMS相关的orf224邻近区域（大约5kb）发生了至少2次重排．pol型及nap型均含各自的特异序列，分别占两个序列的4.53%、3.63%。
　　 ③重复序列分析和SNP分析：pol型基因组序列中，含有大量重复序列，包括l对2427bp的大片段重复序列，和占基因组4.96%的小片段重复序列，以及19组串联重复序列．2.4kb的大片段重复序列与可逆的重排事件有关，导致线粒体基因组的多环分子构型；大量小片段重复序列与线粒体基因组不可逆重排有关，导致特异ORF的产生．nap型与pol型序列间的SNP分析发现，两序列间有197个SNP，核苷酸置换率计算为8.88bp/10kb．除了orf224/orf222区域，在已知基因中仅有6个位点的核苷酸置换发生，说明这两个基因组在编码基因上高度保守。
　　 2．甘蓝型油菜线粒体基因组的构成分析
　　 ①pol型与nap型共存性实验研究：根据pol型与nap型这2个线粒体基因组的差异序列，设计了11对特异性引物．选取包括Pol CMS系、它们的保持系及常规油菜品种，共16份材料，通过特异引物的PCR扩增，发现用所有引物均能从这些材料的高纯度mtDNA中扩增出目的条带，因此证明pol型与nap型共存于甘蓝型油菜的线粒体中。
　　 ②orf222与orf224拷贝数的定量检测：TaqMan qPCR分析发现，Pol不育系中，orf224的拷贝数明显高于orf222的拷贝数；而保持系及其他可育品种中，orf222拷贝数均多于orf224。表明，Pol胞质中pol型是主基因组，nap型则以亚化学计量水平的mtDNA分子存在；而在Nap胞质中则相反．在同一种胞质材料中这2个基因拷贝数比值相差2到6个数量级，这种巨大差异与不同材料的核基因背景有关．不同年份测定结果表明环境也是影响pol型与nap型含量的因素．推测油菜中存在pol型与nap型的亚化学计量转换，导致不育株的出现，从而可能解释了“相同类型不育株为不同育种家所独立发现”的原因．
　　 3．N219A线粒体基因组研究
　　 ①N219A线粒体基因组测序与基因鉴定：利用solexa测序技术，获得了新型细胞质不育系N219A线粒体主基因组精细图．N219A线粒体主基因组是全长为261671bp的双链环状DNA．该基因组合有33个编码蛋白基因、3个核糖体RNA基因和17个tRNA基因．与nap型的基因相比较，N219A线粒体主基因组的orfB基因由于序列不完整，从而影响了该基因功能。同时还鉴定了48个未知功能的ORF，其中31个ORF与nap型完全相同，其它ORF有差异，其中orf153、orf195b、orf130、orf101forf122和orf127是N219A特有序列．
　　 ②比较基因组分析：N219A型与nap型两个基因组的序列插入及缺失现象比较普遍。N219A型缺失了nap型中的4.7kb序列，但插入了39.6 kb的未知来源序列。插入序列中有55.96%的序列与其他植物线粒体基因组具有同源性。N219A型的重复序列占基因组全长的lO．6‰多于nap型。N219A线粒体基因组与油菜线粒体基因组的序列差异可能是由于原生质体融合导致线粒体重组造成的。SNP分析结果表明，两个序列间有305个SNPs，核苷酸置换率为13.7 bp/10 kb．
　　 本研究通过线粒体基因组比较分析，明确了2个不育系线粒体基因组的差异；同时研究发现多种线粒体亚基因组在油菜中普遍共存，对油菜CMS发现与应用提供了新的知识。