红掌愈伤组织和再生团块的发育及四倍体诱导

摘要

本文以红掌（Anthurium andraeanum）叶片和气生根根段为外植体，分别诱导产生愈伤组织和再生团块，并对其分化过程进行了细胞学和组织化学比较研究，旨在了解愈伤组织和再生团块分化过程中细胞学变化异同及糖类和蛋白质在愈伤组织衰老与再生团块发生发育过程中的变化。活性氧与愈伤组织和再生团块的分化关系尚不明确，本文探讨了愈伤组织和团块发育过程中细胞中超氧化物含量、超氧化物歧化酶( SOD)活性、过氧化氢酶(CAT)活性、总谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)活性和丙二醛含量变化，明确了其在愈伤组织和再生团块分化过程中与细胞衰老的关系．气生根来源的再生团块对秋水仙素敏感，本文以其材料，进行了秋水仙素诱导红掌四倍体的研究，这将为红掌四倍体和三倍体育种奠定基础．
　　 1．红掌气生根根段再生快繁体系的建立
　　 以红掌气生根根段为材料，诱导再生团块的产生，建立快繁系统．培养基1/2MS+6-BA1.0mg·L1+2，4-D0.6 mg·L-1适于气生根的保持和繁殖，1/2 MS+6-BA1．Omg·L-1+2，4-D0.2 mg·L-1适于诱导气生根再生团块产生，MS+6-BA1.0 mg·L-1+2，4-D0.2 mg·L-1可使再生团块分化成苗。不论是愈伤组织，还是再生团块，出现绿色组织是分化所必需的。2，4-D、6-BA浓度及其适当比例、无机盐浓度在再生团块的诱导与分化成苗中起着重要作用。
　　 2．叶片来源愈伤组织和气生根来源再生团块细胞学研究
　　 叶片诱导所产生黄绿色、黄色和褐色3种愈伤组织的细胞核质比依次减小，细胞排列越来越疏松，细胞质变稀薄，细胞形态逐渐失去完整性，其中黄色和褐色愈伤组织细胞不断衰老最终死亡．气生根形态发生以间接器官发生为主，再生团块由气生根根段切口皮层细胞分裂和脱分化而来。再生团块内部有密集且分裂旺盛的小细胞团，其细胞为分化的原始组织，是分化产生不定芽的基础。小细胞团芽的分化发生方式属内起源，随着小细胞团的不断生长，外层细胞逐渐凋亡，最终使分化的芽突出再生团块再生成苗，再生团块的形态发生过程中，也偶见有少量胚状体产生．
　　 3．愈伤组织和再生团块发育过程中糖和蛋白质的组织化学比较研究
　　 糖的含量及其梯度变化是愈伤组织和再生团块分化的重要内在条件，蛋白质含量以及核形态是否完整是愈伤组织和再生团块分化的关键。以来源于叶片的4类愈伤组织（黄绿愈伤、深绿愈伤、金黄色愈伤和褐色愈伤）和来源于气生根的再生团块为材料，研究糖和蛋白质在愈伤组织衰老与再生团块发生发育过程中的变化．经石蜡切片PAS和汞溴酚兰组织化学染色观察发现，糖主要以颗粒状存在于愈伤组织细胞中，并有明显的围核现象，蛋白质主要集中于细胞核及其周围。在黄绿愈伤组织中，糖和蛋白质的含量从外向内显著减少；而深绿愈伤组织中梯度变化不明显。在金黄色愈伤组织中糖含量低且内外细胞间梯度小；在褐色愈伤组织中糖散乱分布。在金黄色愈伤组织中，蛋白质含量由外向内有不明显的梯度变化；在褐色愈伤组织中蛋白质则没有梯度变化。新生再生团块细胞中，糖和蛋白质含量高且由外向内梯度变化显著，再生团块膨大过程中，糖和蛋白质含量下降且内外层细胞间差异不显著．再生团块分化过程中，糖主要集中在分裂旺盛的分生细胞团和维管组织周围细胞中，蛋白质则集中于分生细胞团中。在各类愈伤组织和再生团块中均出现含有类似酚类物质的特化细胞。
　　 4．愈伤组织和团块再生体系衰老指标比较研究
　　 以愈伤组织再生体系的4种愈伤组织和气生根再生体系的再生团块为材料，比较了它们之间的超氧化物含量、保护酶活性及丙二醛水平的差异．结果表明：超氧化物含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性及过氧化氢酶(CAT)活性均为黄绿愈伤组织最高，金黄愈伤组织和深绿愈伤组织居中、再生团块和褐色愈伤组织较低；总谷胱甘肽过氧化物酶( GPX)活性以褐色愈伤组织最高，深绿、金黄和黄绿愈伤组织次之，再生团块最低；丙二醛(MDA)含量以金黄愈伤组织最高，褐色、黄绿和深绿愈伤组织次之，再生团块最低．再生团块分化能力最强，而其细胞中超氧化物含量、MDA含量均比4种愈伤组织低，这说明细胞中自由基含量和细胞膜脂过氧化与细胞分化有一定相关性．
　　 5．秋水仙素离体诱导红掌‘亚利桑那’四倍体
　　 红掌“亚利桑那”再生团块经不同浓度的秋水仙素(0.1，0.2，0.3％)分别处理3，5和7h，然后转入附加6-BA3mg·L-1+2，4-D0.2mg·L-1的MS培养基上．60天后，统计团块的成活率和再生苗数．0.3%和7h处理组合显著降低了再生团块存活率，但是秋水仙素对再生团块的分化影响并不显著．所有处理的四倍体植株的诱导率在0.2%到7.6%．最佳诱导率为用0.3%，5h处理组合．四倍体叶片气孔比二倍体的大，但密度却低于二倍体。四倍体植株叶柄粗壮，叶厚且颜色深绿，同二倍体植株相比，佛焰苞更厚更大．四倍体群体中出现双佛焰苞或花梗矮化变异．同二倍体一样，四倍体也可通过气生根产生再生团块，此技术可用于四倍体快速繁殖。