旋毛虫mif基因与mcd-1基因的DNA免疫保护作用以及泛素共表达对DNA免疫影响

摘要

旋毛虫病（Trichinellosis）是由旋毛虫（Trichinella spiralis）引起的一种危害严重的食源性人兽共患寄生虫病，是肉类食品安全性的一个重要指标。在旋毛虫的长期寄生生活中，分泌了大量具有免疫调节功能的蛋白，对宿主免疫系统进行调节，以逃避宿主免疫应答。这些分子除了其免疫调节功能外，还是潜在的疫苗候选分子，将它们应用于疫苗研究中将具有重要意义。泛素(Ubiquitin，Ub)是一个由76个氨基酸残基组成的小蛋白，普遍存在于真核细胞中且序列高度保守。泛素依赖性的蛋白质降解途径是目前已知的重要的、有高度选择性的蛋白降解途径之一。泛素化可对DNA疫苗的免疫应答产生影响。本研究克隆了2个具有免疫调节功能的旋毛虫分泌蛋白基因——旋毛虫巨噬细胞移动抑制因子（Tsmif）和旋毛虫半胱氨酸蛋白酶抑制因子（Tsmcd-1），构建了pVAX1真核表达载体的DNA疫苗，在BALB/c小鼠体内对DNA免疫保护作用进行了研究。结果显示，Tsmif和Tsmcd-1的共表达能够诱导特异性体液免疫应答和细胞免疫应答，并对旋毛虫感染产生部分的免疫保护。此外，与小鼠泛素的共表达增强了细胞免疫应答，并促进了pVAX1-Tsmif-Tsmcd-1免疫产生的抗感染保护能力。
　　 根据GenBank中发表的旋毛虫mif基因（Tsmif）序列(AY050661)和旋毛虫mcd-1基因（Tsmcd-1）序列(DQ777102)，设计引物。以旋毛虫成虫总RNA为模板，RT-PCR扩增出大小2个TsMIF基因片段Tsmif和Tsmif

目录

声明

摘要

前言

第一章 寄生虫MIF研究进展

1．哺乳动物MIF研究进展

1．1 哺乳动物MIF的结构与分布

1．2 哺乳动物MIF的生物学功能

2．寄生虫的MIF同源物

2．1 线虫MIF同源物

2．2 其它寄生生物的MIF

2．3 线虫MIF同源物作为药物靶标

2．4 旋毛虫MIF同源物

参考文献

第二章 寄生虫半胱氨酸蛋白酶抑制因子研究进展

1．寄生虫半胱氨酸蛋白酶抑制因子的类型

1．1 半胱氨酸蛋白酶抑制因子家族1(stefins)

1．2 半胱氨酸蛋白酶抑制因子家族2(cystatins)

1．3 半胱氨酸蛋白酶抑制因子家族3(kininogens)

1．4 不具有半胱氨酸蛋白酶抑制因子活性的cystatin

2．寄生虫半胱氨酸蛋白酶抑制因子的免疫调节特性

2．1 对抗原递呈的调控

2．2 调节细胞因子的产生和T细胞的增殖

2．3 对NO产量的影响

参考文献

第三章 泛素化对DNA免疫的影响

1．DNA疫苗

2．泛素-蛋白酶体系统

2．1 泛素

2．2 蛋白酶体

2．3 蛋白泛素化

2．4 蛋白酶体抑制因子

3．泛素化对DNA免疫的影响

参考文献

第四章 旋毛虫mif基因与mcd-1基因的克隆及其真核表达重组质粒的构建

1．材料

1．1 实验动物

1．2 虫株

1．3 载体与菌株

1．4 酶和试剂

2．方法

2．1 引物的设计与合成

2．2 旋毛虫感染性L1期幼虫和成虫的获取

2．3 PCR扩增目的基因片段

2．4 pVAX1载体重组质粒的构建

2．5 重组质粒pVAX1-Tsmif-Tsmcd-1的构建

3．结果

3．1 PCR扩增目的基因片段

3．2 重组质粒的酶切鉴定

3．3 核苷酸序列和推导的氨基酸序列分析

4．讨论

参考文献

第五章 TsMIF和TsMCD-1的原核表达与重组蛋白(rTsMIF-TsMCD-1)间接ELISA的建立

1．材料

1．1 实验动物

1．2 虫株

1．3 载体与菌株

1．4 酶和试剂

2．方法

2．1 原核表达

2．2 重组蛋白rTsMIF-TsMCD-1间接ELISA的建立

3．结果

3．1 原核表达

3．2 间接ELISA最佳抗原包被浓度和适抗体工作浓度的确定

4．讨论

参考文献

第六章 Tsmif和Tsmcd-1重组质粒的DNA免疫

1．材料

1．1 实验动物

1．2 虫株

1．3 载体与菌株

1．4 酶和试剂

2．方法

2．1 重组质粒的制备

2．2 免疫

2．3 质粒DNA在小鼠体内表达情况的检测

2．4 血清抗体水平的检测

2．5 血清细胞因子水平的检测

2．6 CD4+／CD8+T细胞分析

2．7 攻虫保护试验

3．结果

3．1 质粒DNA在小鼠体内表达情况的检测

3．2 血清抗体水平的检测

3．3 血清细胞因子水平的检测

3．4 CD4+／CD8+T细胞分析

3．5 攻虫保护试验

4．讨论

参考文献

第七章 泛素共表达对Tsmif和Tsmcd-1 DNA免疫的影响

1．材料

1．1 实验动物

1．2 虫株

1．3 载体与菌株

1．4 酶和试剂

2．方法

2．1 泛素共表达重组质粒的构建

2．2 DNA免疫

2．3 泛素化对体外表达靶蛋白的降解作用

2．4 血清抗体水平的检测

2．5 血清细胞因子水平的检测

2．6 CD4+／CD8+T细胞分析

2．7 CTL活性分析

2．8 攻虫保护试验

3．结果

3．1 泛素共表达重组质粒的构建

3．2 泛素化对靶基因的体外降解作用

3．3 血清抗体水平的检测

3．4 血清细胞因子水平的检测

3．5 CD4+／CD8+T细胞分析

3．6 CTL活性分析

3．7 攻虫保护试验

4．讨论

参考文献

全文总结

致谢

论文发表情况