氟铃脲降解菌的分离鉴定、降解特性及降解氟铃脲的酰胺酶基因(amiH)的克隆和表达

摘要

氟铃脲是美国陶氏益农公司1987年开发生产的一种高效、广谱、低毒的苯甲酰脲类杀虫剂，几丁质合成抑制剂，通过抑制几丁质的合成杀死害虫。它是国家石化局和农业部制定的中国农药工业“十五”发展规划要求中的高毒有机磷农药的替代品种之一。被广泛用于蔬菜、棉花和果树的害虫防治，及真菌引起的植物病害。但是氟铃脲在作物上的不正确使用也会引起药害、对鱼类和家蚕毒性大。
　　 目前的研究主要集中在氟铃脲的药效、杀虫效果、农药残留与毒性，以及在土壤中的降解动态。对于分离到的纯种微生物对氟铃脲的降解鲜有报道，没有对其代谢途径与酶进行研究。
　　 从农药厂废水处理池的活性污泥中分离到1株能降解氟铃脲的菌株，命名为FLN-7，GenBank序列号为(EU725799)。根据表型特征、生理生化特性及16S rRNA序列同源性分析，将FLN-7归类为副球菌属(Paracoccus sp.)，研究结果表明该菌能在含氟铃脲(50 mg·L-1)的基础盐液体培养基中降解氟铃脲，7d降解率达89％。研究了它的生长特性、对氟铃脲的降解特性。通过高效液相色谱与质谱推断出氟铃脲在Paracoccus sp.FLN-7体内代谢过程的起始反应是断裂其结构核心的一个酰胺键。
　　 通过构建基因组DNA文库，成功地从氟铃脲降解菌株Paracoccus sp.FLN-7中克隆到一个酰胺酶基因，命名为amiH。该基因含1395个碱基，编码465个氨基酸，G+Cmol％含量为67.81％，通过Omiga分析AmiH是分子量为49.6kD，等电点(pI)为5.3的酶。
　　 以pET29a为载体，构建表达质粒pET29a-amiH，实现了AmiH蛋白在E.coli BL21(DE3)中的融合表达。降解实验表明AmiH能够降解氟铃脲、敌稗、乐果、氯苯胺灵、甲酰胺、乙酰胺、丙酰胺、丙烯酰胺、苯甲酰胺和尿素多种酰胺类化合物。