野生茄子托鲁巴姆黄萎病抗性相关基因StoVel功能鉴定

摘要

黄萎病是一种危害性很大的植物维管束病害，严重影响着番茄、茄子、棉花、马铃薯等重要农作物的产量和品质。选育抗黄萎病的新品种，是控制植物黄萎病危害的最好途径。可是，在现有的栽培品种中，抗病基因严重缺乏，从野生茄子Solanum torvum中克隆黄萎病抗性相关基因，并转化植物，对植物黄萎病抗病育种具有重要意义。
　　 根据本实验室克隆的抗黄萎病相关基因StoVel的cDNA序列，设计引物，获得全长，构建表达载体pCAMBIA1304-StoVel，通过农杆菌介导的遗传转化方法将StoVe1基因转化到马铃薯和烟草基因组中。
　　 主要研究结果如下：
　　 马铃薯Désirée遗传转化。以茎段为外植体，获得了25个潮霉素抗性株系，PCR检测，有12株为阳性，其中10株表现为GUS染色阳性。基因表达分析表明，转基因株系C9、C17和C24中StoVe1基因表达量高于野生型对照，是其5～9倍。提取马铃薯植株粗蛋白进行体外抑菌实验，转基因株系C9、C17和C24蛋白提取物均明显抑制Verticillium dahliae的生长。对这三个转基因马铃薯株系进行V.dahliae侵染实验，结果显示，与对照相比，三个转基因马铃薯株系表现出不同程度的抗性，其病情指数和发病率均低于对照。
　　 烟草NC89遗传转化。以叶片为外殖体，共得到了12个烟草抗性株系，7株表现为PCR阳性，选取三株转基因烟草T14、T11和T7，qRT-PCR分析显示，转基因株系StoVe1基因表达量均比对照高，为对照的2-6倍，提取叶片总蛋白粗提液，进行体外抑菌试验，结果表明，转基因烟草具有显著的抑菌效果。
　　 为了研究茄科种属间Ve1基因的同源关系，从野生茄子托鲁巴姆中克隆了StoVe1基因DNA序列及苏崎茄，马铃薯和烟草中Ve1基因DNA中间片段序列。SMART软件在线分析显示，Stovel具有15个亮氨酸重复序列(LRR)，富含LRR是抗病相关蛋白的特征之一。托鲁巴姆、马铃薯和烟草中间片段都含5个LRR，而苏崎茄含4个。通过NCBI在线进行氨基酸序列比对(Blastp)显示，托鲁巴姆Ve1基因与其它茄科植物一致性最高。选取具有代表的Ve氨基酸序列构建Ve蛋白的系统进化树，马铃薯和烟草在同一簇内，一致性较高，苏崎茄和托鲁巴姆的遗传距离可能与抗黄萎病能力差异有关。