多菌灵降解菌的分离鉴定、生物学特性及多菌灵水解酶基因的克隆和表达研究

摘要

从长期施用多菌灵的土壤中分离得到两株多菌灵降解菌mbc-1和mbc-2，根据生理生化特征分析及16S rRNA基因相似性序列比较，分别将其鉴定Mycobacterium sp。(GenBank Accession No.HQ873672)和Nocardioides sp.(GenBank Accession No。JF937914)。
　　 菌株mbc-1和mbc-2在pH值为6.0～8.0，生长良好，最适pH均为7.0。mbc-1和mbc-2的最适生长温度均为30℃。mbc-1和mbc-2的最适生长碳源为葡萄糖，最适有机氮源均为酵母膏，mbc-1的最适无机氮源为硝酸钾，而mbc-2的最适无机氮源为尿素。
　　 菌株mbc-1和mbc-2均能以多菌灵为唯一碳源生长，在多菌灵浓度为50mg·L-1的无机盐培养基中，mbc-1和mbc-2在84h之内对其降解率分别为97.9％和86.1％。mbc-1和mbc-2降解多菌灵的最适温度均为30℃，最适pH均为7.0。对菌株mbc-1和mbc-2代谢多菌灵途径的初步研究显示，它们首先将多菌灵转化为2-氨基苯并咪唑然后进一步转化为2-羟基苯并咪唑，直至完全降解。
　　 根据已报道的多菌灵水解酶基因(mheI)设计引物，通过PCR的方法从mbc-1和mbc-2中克隆了该基因。序列测定和比对结果显示，它们与已报道的唯一的多菌灵水解酶基因mheI(Nocardioides sp.SG-4G，GQ454794.1)基因同源性均为99％。将该基因构建到表达载体pET29a上，转化到E.coli BL21(DE3)中进行了表达，得到了分子量符合预期大小的蛋白质(24.3KD)，该蛋白具有多菌灵水解酶活性。
　　 基于多菌灵水解酶基因序列在几株菌中高度保守，为了研究其是否和基因水平转移元件相连，我们通过染色体步移(chromosome walking)的方法，分别从mbc-1和mbc-2中获得了mheI基因上游和下游DNA片段，拼接后大小为5983bp和4529bp，其中mbc-1包括orf1(与alcohol dehydrogenase相似性最大，为57％)，orf2(与L-asparaginaseⅡ相似性最大，为92％)，orf3(与binding-protein dependent transport system innermembrane protein相似性最大，为96％)，orf4(与ABC transporter-like protein相似性最大，为95％)；mbc-2包括orf1(与 L-asparaginaseⅡ相似性最大，为92％)，orf2，orf3(与alcohol dehydrogenase相似性最大，为34％)，orf4(与ABC transporterpermease protein相似性为79％)orf5(与ABC transporter-like protein相似性最大，为95％)。现有结果没有发现和基因水平转移相关的证据，但是还有待进一步研究。