水稻磷脂酶C调节耐盐性以及磷脂酶D参与种子老化的研究

摘要

至今为止，在植物和细胞中发现三类磷脂酶，按其水解磷脂部位的不同分别命名为磷脂酶A、磷脂酶C和磷脂酶D。这些磷脂酶参与了植物生长、发育和逆境胁迫等多个生理过程。但是，这三种磷脂酶都是由多基因组成的，从分子水平上阐明各基因与基因对应的生理功能关系的报道尚不多见。在本研究中，我们鉴定出水稻PLC3（OsPLC3）与耐盐性有关，该基因属于PI-PLC。我们还研究了种子老化中磷脂水平的变化及膜与PLD的关系，具体结果如下。
　　 磷脂酶C根据其作用底物的不同又可以分为底物非特异性磷脂酶C(NPC)和磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)。PI-PLC水解磷脂酰肌醇4，5-二磷酸(PI(4，5)P2)，同时生成两个重要的第二信使分子二酰甘油(DAG)和肌醇三磷酸(IP3)。通过对水稻基因组的搜索发现，水稻基因组中共有4个PLC，分别位于第3、5、7和12对染色体上。我们分析了水稻PLC在各个组织中的表达，发现OsPLC1在各组织中表达均较低;OsPLC2在根中和幼叶中的表达量较高;OsPLC3在老叶片中的表达量相对较高;OsPLC4在根中表达较高。同时还发现OsPLCs对低温、ABA、干旱和盐胁迫均有不同程度的应答。盐胁迫下，OsPLC1表达基本不变;OsPLC2表达先上升，然后下降;OsPLC3和OsPLC4随盐处理时间延长而表达不断增加。其中，OsPLC3表达增加最显著。我们获得了OsPLC2和OsPLC3的突变体，对其功能作了深入研究。通过原核表达的方式在大肠杆菌BL21中分别表达了OsPLC2和OsPLC3。通过对PI(4)P、PI(4，5)P2和PC的水解能力分析，发现OsPLC2和OsPLC3都可以水解PI(4)P和PI(4，5)P2，但不水解PC，这说明了OsPLC2和OsPLC3属于PI-PLC。通过水稻原生质体的瞬时表达，发现OsPLC2-YFP和OsPLC3-YFP定位于原生质体的质膜上。利用基因枪将OsPLC2-YFP和OsPLC3-YFP转入洋葱表皮细胞中进行表达，通过质壁分离后进一步证实了OsPLC2和OsPLC3定位在质膜上。
　　 我们鉴定并获得了Tos17插入OsPLC2和OsPLC3的突变体。在正常生长条件下，osplc3的多个农艺性状与野生型具有显著差异，株高、结实率下降。osplc3植株中DAG和PA的含量也明显的低于野生型。通过对干旱和盐胁迫下的表型分析发现，osplc3对盐处理十分敏感，osplc2对两种胁迫的表型与野生型(WT)没有明显差异。盐胁迫处理后，osplc3植株中地上部与地下部的Na+含量明显高于WT和osplc2，并且其Na+/K+比值也显著高于野生型。这些实验结果说明OsPLC3在水稻耐盐胁迫应答中起正调节作用。基于这种些结果，我们进一步分析了一系列与盐胁迫相关的基因的表达。结果显示，在盐胁迫处理下，OsPLC3的缺失可以明显抑制多个受盐诱导的基因的表达，包括OsbZIP23、OsP5CS、OsHKT;1、OsMSR2、OsLEA3和OsCDPK7。其中已知，OsMSR2、OsLEA3和OsCDPK7是受钙信号调控的，而PLC水解产物之一IP3可以触发细胞内钙库释放Ca2+。由此推测，OsPLC3可能至少是部分通过IP3-Ca2+途径来调控水稻耐盐反应的。
　　 对水稻种子人工老化过程中脂类含量变化的研究发现，随着种子人工老化，磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)和磷脂酰甘油(PG)等磷脂的含量显著降低。而作为磷脂酶D的水解产物，磷脂酸的含量显著升高。有趣的是，升高磷脂酸的分子种与降低的PC、PE的分子种都是一致的，从此可以推测升高的磷脂酸可能是从磷脂酶D水解PC或（和）PE而来。通过基因表达量分析，我们发现水稻种子中OsPLDα1和α3是主要的PLDα，而且种子人工老化可以增加OsPLDα1和OsPLDα3的表达。种子人工老化还可以诱导PLDα蛋白的表达，提高其活性。我们又分析了种子人工老化过程中三个LOX基因的表达情况，发现种子人工老化可以诱导OsLOX2表达。
　　 总之，通过遗传学、分子生物学和生理学等手段，我们鉴定了OsPLC3是PI-PLC，并正向调节水稻耐盐性。我们还发现了OsPLDα参与了水稻种子的老化过程。这些发现，促进了我们对植物磷脂酶和磷脂变化在植物逆境和衰老中作用的了解。

目录

声明

摘要

符号及缩略语(Abbreviation)表

第一章 文献综述

第一节 脂代谢与信号作用

1 脂组分的改变及其作用

2 磷脂对离子通道的调控作用

3 磷脂和蛋白之间的相互作用

4 脂信号分子及其信号转导途径

第二节 磷脂酶家族及其信号作用

1 磷脂酶A研究进展

2 磷脂酶C研究进展

3 磷脂酶D研究进展

4 磷脂酸信号转导途径

第三节 脂介导的植物耐盐信号及耐盐机理

1 植物盐害的生理过程

2 植物盐胁迫与Na+运输

3 植物盐胁迫与C1ˉ运输

4 植物盐胁迫与活性氧爆发

5 脂介导的植物耐盐信号

第四节 脂降解与植物细胞核组织衰老

1 种子老化的复杂性

2 种子老化对生理机能的影响

3 脂的过氧化

4 种子老化模型的研究

第五节 问题与展望

第二章 水稻PLC基因表达、活性测定和细胞定位

1 材料与方法

1．1 水稻材料与培养

1．2 水稻幼苗胁迫处理

1．3 水稻RNA的提取与cDNA第一链的合成

1．4 定量PCR分析

1．5 OsPLC基因的克隆和原核表达载体的构建

1．6 质粒的小量提取

1．7 质粒的大量提取和纯化

1．8 电击感受态的制备、转化和菌落PCR鉴定

1．9 GST融合蛋白在BL21菌株中的表达和纯化

1．10 OsPLC蛋白的WeStern blotting检测

1．11 OsPLC活性测定

1．12 OsPLC2和OsPLC3亚细胞定位载体的构建

1．13 基因枪法转化洋葱表皮

1．14 水稻原生质体的提取及转化

1．15 OsPLC2和OsPLC3在原生质体中的亚细胞定位

2 结果与分析

2．1 水稻PLC基因家族分析

2．2 水稻PLC各组织表达分析

2．3 水稻PLC在逆境胁迫后的表达量变化

2．4 水稻PLC的克隆与原核表达载体的构建

2．5 水稻PLC蛋白原核表达与纯化

2．6 水稻PLC蛋白活性的测定

2．7 水稻PLC-YFP载体的构建

2．8 水稻PLC基因在洋葱表皮中的亚细胞定位

2．9 水稻PLC基因在原生质体中的亚细胞定位

3 讨论

第三章 水稻PLC基因的耐盐性分析

1 材料与方法

1．1 实验材料

1．2 水稻基因组DNA的提取

1．3 osplc2和osplc3突变体鉴定

1．4 OsPLC活性测定

1．5 osplc2和osplc3突变体农艺性状分析

1．6 水稻脂的提取及含量测定

1．7 水稻逆境处理及失水率计算

1．8 Na+、K+离子含量测定

1．9 水稻叶片气孔开闭观察

1．10 水稻叶片保卫细胞的分离与Ca2+含量的测定

1．11 qRT-PCR分析osplc3对其他盐敏感基因表达的影响

2 结果与分析

2．1 osplc2和osplc3突变体鉴定

2．2 osplc2和osplc3突变体农艺性状差异分析

2．3 OsPLC3突变对水稻叶片PA和DAG含量的影响

2．4 盐和干旱胁迫下OsPLC2和OsPLC3突变对失水的影响

2．5 盐和干旱胁迫下OsPLC2和OsPLC3的突变对干旱和盐胁迫下生长的影响

2．6 盐和干旱胁迫下OsPLC2和OsPLC3的突变对Na+、K+离子含量的影响

2．7 OsPLC3突变对盐胁迫下水稻叶片气孔关闭的抑制作用

2．8 ABA介导的OsPLC3对水稻保卫细胞Ca2+含量的调控

2．9 OsPLC3突变对盐敏感基因表达的影响

3 讨论

第四章 水稻种子老化与PLD关系的研究

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 水稻种子人工老化条件的建立

1．3 水稻种子发芽率的测定

1．4 水稻种子磷脂提取

1．5 水稻种子总RNA的提取与cDNA的合成

1．6 定量PCR分析OsPLDαs基因表达变化

1．7 水稻种子总蛋白的提取

1．8 蛋白含量的测定

1．9 水稻种子OsPLDα活性的测定

1．10 Western blotting检测OsPLDα表达

1．11 LOX活性的测定

1．12 茉莉酸含量测定

2 结果与分析

2．1 人工老化处理对水稻种子萌发率的影响

2．2 水稻种子人工老化对幼苗生长状态的影响

2．3 人工老化处理对种子磷脂含量的影响

2．4 人工老化处理对种子各种磷脂分子种含量的影响

2．5 水稻种子人工老化过程中OsPLDαs表达量的变化

2．6 人工老化处理对OsPLDα蛋白含量与活性的影响

2．7 水稻种子人工老化过程中OsLOXS表达量与活性的变化

3 讨论

全文讨论

全文结论和创新之处

参考文献

附表一：木村B营养液配方

附表二：原生质体提取所需试剂配方

附录

致谢