作物缺磷和菌根信号转导途径中调控基因的鉴定与功能验证

摘要

磷(Phosphorus，P)是植物生长发育必需的大量营养元素之一，广泛地参与到植物体内的能量转移、信号转导、光合作用等过程。它还是许多生物大分子如核酸、磷脂和含磷蛋白酶类的重要组成部分。然而，由于P在土壤中容易被固定和沉淀，且植物从土壤中吸收的主要是无机态正磷酸盐(Phosphate，Pi)，故相对于其他营养元素，P在土壤中的移动性和有效性均很低，其也因此常常成为农田及自然生态系统中植物生长的主要限制因子之一。植物在漫长的进化过程中发展出了一套适应缺磷环境的形态变化及生理生化方面的机制，包括根系构型的改变、酸性磷酸酶、RNA酶及有机酸的分泌、与丛枝菌根真菌(AMF，(A)rbuscular(M)ycorrhizal(F)ungi)形成共生体系等等。
　　 植物对缺磷环境的这些适应性机制都是由其背后一系列精巧的分子机制作为支撑的。近年来，该研究领域科学家们针对这些分子机制做了大量的研究，初步构建了植物缺磷和菌根共生信号转导途径的分子调控网络。这个网络中的“节点”，即基因之间在不同水平存在着复杂的调控或被调控的关系。一个基因在表达丰度或时间空间上的变化可能会造成整个网络的重新调整。虽然我们对植物缺磷和菌根共生信号转导途径这两个分子调控网络的认识正不断深入，发现了在前者中起中心调控作用并可能连接两个网络的关键调控因子PHR((PH)osphate Starvation(R)esponse)，但根据近年来该领域的研究进展来看，欲全面揭开其神秘的面纱仍有诸多工作要做。为了对这两个网络进行进一步的补充完善，本研究以鉴定植物中参与到缺磷和菌根共生信号途径中的微小RNA(microRNA，miRNA)和转录因子基因两方面作为切入点，取得了以下的主要结果:
　　 1.根据已知植物中所有miRNA的成熟片段序列，与茄科植物烟草的GSS(Genome Survey Sequence)和EST(Expressed Sequence Tag)序列进行比对，继而由生物信息学技术从烟草中预测到分属于84个家族共计276个miRNA基因，并分析了全部276个基因的一系列特征参数。发现烟草miRNA也是以多基因家族的方式出现;其成熟片段和前体结构的长度分别集中在21个碱基和75-114个碱基左右;90％以上miRNA前体的A和U含量之和在50％-70％之间;在不同物种中非常保守的缺磷诱导表达的miR399和miR827在缺磷条件下的烟草中表达也发生上调。
　　 2.通过miRNA基因芯片结合实验验证的方法在茄科植物番茄中鉴定出23个保守的miRNA，发现其中16个受到磷素营养或菌根共生信号或二者共同的调控。证明了miRNA基因表达的变化也是植物缺磷和菌根共生信号转导途径中重要的组成部分，且植物缺磷和菌根共生信号转导途径存在部分重叠。
　　 3.采用RT-PCR方法结合生物信息学及组织化学分析研究了水稻中缺磷诱导表达的miRNA基因，osa-miR827a(OsmiR827a)及其靶基因。发现OsmiR827a受缺磷信号专一性诱导表达，且其成熟片段可能作为长距离运输信号分子通过韧皮部从地上部转运到地下部。此外，结果表明虽然miRNA827在不同物种中非常保守，但其对靶基因的调控机制可能在单子叶和双子叶植物物种分化的过程中发生了变异。不同于拟南芥AtmiR827的靶基因AtNLA((N)itrogen(L)imitation(A)daptation;属于SPX家族中的SPX-RING亚家族），水稻OsmiR827a的靶基因属于SPX家族中的SPX-MFS-1亚家族，且其靶基因有两个，OsSPX7和OsSPX8。虽然二者的氨基酸序列一致性大于80％、结构高度相似且都定位于细胞质膜上，但对缺磷信号的响应却完全相反。
　　 4.对OsSXP7和OsSPX8两个基因各两个株系的Tosl7转座子插入突变体(osspx7-1、osspx7-2和osspx8-1、osspx8-2)在不同供磷条件下的表型、有效磷含量等生理指标进行测定后发现，osspx7-2在高磷和全铵营养且高磷处理下表现出磷中毒的症状，其叶片中有效磷浓度在两种处理下分别为野生型植株的6.2倍和3.8倍，在低磷条件下其叶片中有效磷浓度与野生型植株相比提高了1倍;对于OsSPX8两个株系的突变体osspx8-1和osspx8-2，只有在高磷和全铵营养且高磷两种条件下，其叶片中的有效磷含量比野生型植株提高40％左右。此外，通过对突变体中磷酸盐转运蛋白(PT，Phosphate Transporter)基因及其它缺磷信号转导途径中基因表达的检测及与其它在正常供磷条件下表现出磷中毒症状的突变体或转基因植株的情况相比较，我们推测OsSXP7和OsSPX8至少部分是通过抑制PT基因表达来实现其在植物体内磷的动态平衡过程中的作用。
　　 5.在水稻缺磷信号转导途径中心调控因子基因OsPHR2（(PH)osphate Starvation(R)esponse(2))的过量表达植株中对OsmiR827a的表达丰度进行了检测，结果表明OsmiR827a可能是新发现的由OsPHR2直接调控的下游基因。
　　 6.通过将番茄中菌根特异表达PT基因LePT4的启动子进行分割和定点突变、融合GUS报告基因继而由根癌农杆菌介导的转基因方法转入烟草中检测分析，证明了缺磷信号转导途径中的关键顺式调控元件P1BS((P)HR1 Binding Sequence)对茄科植物中菌根诱导或特异表达的PT基因的转录激活是必不可少的。而此转录激活过程不需要调控豆科植物血红蛋白基因在根瘤和菌根组织特异性表达相关的NODCON2GM和参与植物的防御反应的WRKY710S这两个顺式调控元件的参与。
　　 7.根据拟南芥和水稻中PHR基因的保守序列设计简并引物，以烟草cDNA为模板进行PCR扩增、测序获得其保守区序列后通过RLM-RACE方法获得了烟草PHR同源基因NtPHR2的cDNA全长序列。氨基酸序列比对和进化树分析结果表明，NtPHR2与拟南芥AtPHR1和水稻OsPHR2一样属于MYB转录因子家族中的MYB-CC(Coiled-Coil)亚家族，且与AtPHR1的亲缘关系最近。
　　 8.通过基因枪轰击洋葱表皮、RT-PCR和酵母双杂交系统对与烟草中菌根相关候选转录因子基因NtMYCF1和NtPHR2的亚细胞定位、表达模式及其蛋白水平的相互作用作了分析。结果表明，NtMYCF1和NtPHR2均定位在细胞核;NtMYCF1在根部受菌根诱导表达，NtPHR2在根部和叶片中均为组成型表达;NtMYCF1和NtPHR2在蛋白水平可能不发生互作。

目录

声明

摘要

英文缩略符及其中英文对照表

第一章 文献综述——植物缺磷及菌根信号转导的分子信号网络

1 缺磷信号转导途径相关基因

1．1 转录因子基因

1．2 PHF1

1．3 AtSIZ1

1．4 microRNA

1．5 TPSI1-Mt4，At4／IPS1

1．6 PHO

1．7 SPX家族

2 菌根共生信号转导途径相关基因

3 结语

第二章 研究方案及技术路线

第三章 烟草中miRNA的生物信息学预测

1 引言

2 材料与方法

2．1 生物材料

2．2 烟草GSS和EST序列及植物中已知miRNA成熟片段序列的获得

2．3 烟草中保守miRNA的预测

2．4 烟草缺磷处理

3 结果与分析

3．1 所预测miRNA各家族成员数统计

3．2 所预测miRNA成熟片段及前体长度分布

3．3 所预测miRNA特征参数统计

3．4 部分miRNA二级结构折叠

3．5 烟草miRNA399和miRNA827家族部分成员表达模式研究

4 讨论

第四章 缺磷和菌根侵染条件下番茄中miRNA表达谱的芯片分析及验证

1 引言

2 材料与方法

2．1 生物材料

2．2 番茄缺磷和菌根侵染处理

2．3 采样

2．4 菌根真菌侵染率的测定

2．5 miRNA芯片制作及数据处理

2．6 RNA提取及poly(A)-tailed RT-PCR分析

3 结果与分析

3．1 加磷、缺磷及缺磷加菌根三种处理材料的检测

3．2 miRNA芯片结果筛选

3．3 miRNA芯片结果的验证

3．4 差异表达miRNA靶基因的生物信息学预测及功能分类

4 讨论

第五章 缺磷诱导OsmiR827a及其靶基因的生物信息学和表达模式分析

1．引言

2．材料与方法

2．1 生物材料

2．2 OsmiR827a靶基因的预测

2．3 OsSPX7和OsSPX8氨基酸序列及结构域分析

2．4 水稻和拟南芥中SPX家族成员进化树分析

2．5 OsSPX7、OsSPX8及部分SPX家族其它成员亚细胞定位分析

2．6 RT-PCR检测分析

2．7 OsmiR827a、OsSPX7和OsSPX8启动子序列分析

2．8 农杆菌介导的水稻转基因

2．9 GUS报告基因的检测

3 结果与分析

3．1 miR827成熟片段在不同物种间的保守性分析

3．2 OsmiR827a靶基因的预测及分析

3．3 缺磷信号对OsmiR827a、OsSPX7和OsSPX8表达的影响

3．4 OsmiR827a、OsSPX7和OsSPX8启动子及组织定位分析

4 讨论

第六章 OsmiR827a及其靶基因的功能研究

1 引言

2 材料与方法

2．1 生物材料

2．2 农杆菌介导的水稻转基因

2．3 植物有效磷浓度的测定

2．4 RT-PCR检测分析

3 结果与分析

3．1 OsmiR827a过量表达植株的获得和鉴定

3．2 OsSPX7和OsSPX8突变纯合体的鉴定

3．3 OsSPX7和OsSPX8突变纯合体敲除效果的检测

3．4 OsSPX7和OsSPX8突变体在不同供磷处理下的表型分析

3．4 OsSPX7和OsSPX8突变体在不同供磷处理下有效磷浓度的变化

3．5 OsSPX7和OsSPX8突变对PT基因及缺磷信号转导途径中其它基因转录水平表达的影响

3．6 OsPHR2对OsmiR827a的调控分析

4 讨论

第七章 番茄和烟草Pht1；4基因启动子功能区域分析

1 引言

2 材料与方法

2．1 生物材料

2．2 重叠延伸PCR

2．3 烟草转基因操作

2．4 凝胶阻滞实验

3 结果与分析

3．1 LePT4启动子序列分析

3．2 LePT4启动子分割及定点突变

3．3 不同长度及定点突变LePT4启动子组织特异活性分析

3．4 NtPT4启动子片段与核蛋白体外结合活性分析

3．5 顺式调控元件PIBS在NtPT4响应菌根信号过程中功能解析

4 讨论

第八章 烟草缺磷和菌根信号途径转录因子基因NtPHR2和NtMYCF1的克隆、分析及表达模式研究

1 引言

2 材料与方法

2．1 生物材料

2．2 cDNA全长扩增

2．3 MYB-CC家族成员进化树分析

2．4 基因枪轰击洋葱表皮的亚细胞定位实验

2．5 酵母双杂交实验

3 结果与分析

3．1 烟草中PHR同源基因cDNA全长的克隆及序列、进化树分析

3．2 NtMYCF1和NtPHR2亚细胞定位分析

3．3 NtMYCF1和NtPHR2在缺磷及菌根共生条件下的表达模式分析

3．4 NtMYCF1和NtPHR2在蛋白水平互作分析

4 讨论

全文结论

创新点

参考文献

附录

在读期间发表的论文

致谢