中国荷斯坦牛C4A基因的遗传变异及其作为乳腺炎抗性标记的可行性分析

摘要

补体成分4(Complement component4，C4)是补体经典途径和凝集素途径中的一个重要成分，血清含量仅次于C3位居第二。在补体激活和抵抗外源微生物侵入中发挥着积极作用的C4，主要在肝脏中表达，一些肝外组织如心脏、肺脏、脾脏、肾脏、大脑、甲状腺和乳腺中也有表达。C4是补体系统中多态含量最高的成分，其结构基因位于主要组织相容性复合物区。因此，研究C4意义更显得重要。
　　 1.C4A基因多态性与奶牛生产性状关联性分析
　　 本研究以1182头中国荷斯坦牛，利用PCR-RFLP和DNA测序等方法检测牛C4A基因中未报道的单核苷酸多态性(SNPs)位点，并将发现的这些SNPs位点及其构建的不同单倍型组合与奶牛产奶性状进行关联性分析，筛查与奶牛产奶性状相关的分子标记，为培育高产奶量、高乳蛋白及高乳脂率奶牛提供参考依据。通过C4浓度、抗菌活性和补体活性三个指标，验证其抗性效果。
　　 序列分析比对显示:外显子10存在g.2994 A＞G突变，外显子12含g.3508A＞G和g.3649 G＞C突变。试验群体中SNPs组成的单倍型有8种，满足统计分析数量的单倍型组合为7种。统计分析发现g.2994 A＞G-AG和g.3649 G＞C-CC个体牛的SCS较其它基因型低(P＜0.01); H5H5(GAC/GAC)为乳腺炎抗性单倍型组合，H2H1(AAG/AAC)是易感性群体。两种组合对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌活性差异极显著(P＜0.001);各基因型C4浓度差异不显著，但H5H7个体较H5H5高(P＜0.05）。
　　 2.C4A基因可变剪切体的寻找
　　 根据体细胞评分和奶样病原菌鉴定结果，将6头奶牛分为健康组和乳腺炎组。利用RT-PCR和克隆测序技术，在肝脏和乳腺组织中发现一种形式为内含子10保留的可变剪切体，即C4A-AS。两种转录本在研究个体的心脏、肾脏、肝脏、脾脏、肺脏、肌肉、乳腺和舌中都有表达，且在健康奶牛组织中表达差异极显著(P＜0.001)，在乳腺炎奶牛中差异不显著(P=0.257）;乳腺炎发生时C4A-AS的表达量显著增加(P=0.030)。
　　 3.C4A基因启动子活性分析
　　 利用在线预测软件对牛C4A基因的5'侧翼区序列进行生物信息学分析，成功构建了一系列表达载体，利用双荧光素酶报告基因检测系统分析牛C4A基因的5'侧翼区启动活性。分别通过定点突变技术构建突变质粒和脂多糖刺激试验，研究调控C4基本表达和诱导表达的转录因子结合位点。利用EMSA技术验证转录因子在研究细胞系中存在与否。
　　 C4A基因启动子序列存在两个SNP位点，即g.-889 C＞T和g.+147 G＞A。其中，位于内含子1的g.+147 G＞A位点与血清C4浓度相关，可能调控C4的表达。C4A基因启动子序列转录起始位点上游169 bp为报告基因荧光值最高的片段，即为启动子核心区;其中SP1(-169～-158)、E-box(-122～-117)和AP-1(-80～-71)是调控C4基本表达的主要转录因子结合位点。其中，AP-1在脂多糖刺激C4表达中发挥作用，而且这三个转录因子在HepG2细胞系中真实存在。
　　 综上所述，C4A基因可作为奶牛乳腺炎抗性育种的候选基因。当然奶牛乳腺炎抗性育种仅仅为控制乳腺炎工作的一部分，即从“本”上治疗奶牛乳腺炎;同时在奶牛饲养中应加强管理、注重营养平衡，从“标”上减少乳腺炎的发生。

目录

声明

论文说明

摘要

缩略词(Abbreviation)

第一章 乳腺炎及相关抗性基因的研究进展

1 乳腺炎概况

1．1 奶牛乳腺炎的发生

1．2 奶牛乳腺炎的危害

1．3 乳腺炎的治疗手段

1．4 乳腺炎遗传学研究

2 乳腺炎抗性候选基因研究现状

2．1 β-防御素

2．2 牛主要组织相容性复合物(BoLA)基因

2．3 热休克蛋白70

2．4 Toll样受体基因

2．5 溶质转运家族11成员1(Slc11A1)基因

2．6 乳铁蛋白

2．7 其他

3 C4基因研究进展

3．1 C4结构和功能

3．2 C4基因多态性研究

4 本项目的研究目的和意义

参考文献

第二章 C4A基因多态性研究

1 材料与方法

1．1 试验动物

1．2 仪器设备及试剂

1．3 试验方法

2 试验结果

2．1 牛C4A基因多态位点的筛查

2．2 牛C4A基因多态性分析结果

2．3 数据统计分析结果

2．4 单倍型分析结果

参考文献

第三章 C4A多态性与乳腺炎的相关分析及其验证

1 材料与方法

1．1 试验动物

1．2 仪器设备及试剂

1．3 抗性效果验证

1．4 统计分析

2 试验结果

2．1 多态位点与奶牛产奶性状的相关性分析

2．2 多态位点与奶牛C4浓度和CH50的相关性分析

2．3 单倍型组合与奶牛产奶性状的相关性分析

2．4 单倍型组合与奶牛C4浓度和CH50的相关性分析

2．5 抗菌活性分析结果

3 讨论

参考文献

第四章 C4A可变剪切体的鉴定与表达

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 仪器设备及试剂

1．3 试验方法

2 试验结果

2．1 奶样病原菌鉴定结果

2．2 RNA检测

2．3 可变剪切体的鉴定

2．4 可变剪切体的定量分析

3 讨论

参考文献

第五章 C4A基因启动子功能和SNPs分析

1 材料与方法

1．1 试验动物

1．2 仪器设备及试剂

1．3 试验方法

2 试验结果

2．1 重组质粒鉴定结果

2．2 启动子序列及结构

2．3 SNPs与C4浓度的相关性

2．4 牛C4A基因5’调控区的转录活性

2．5 LPS对牛C4A 5’调控区启动子活性的影响

2．6 EMSA结果

3 讨论

参考文献

全文总结

附录

致谢

作者简介

攻读硕士期间发表论文