基因4型猪戊型肝炎病毒SASAS-FX17株感染性克隆的构建

摘要

戊型肝炎(hepatitis E，HE)是由戊型肝炎病毒（hepatitis E virus，HEV）引起的一种经粪，口途径传播的疾病，是一种人畜共患病。戊型肝炎病毒主要侵犯青壮年和孕妇，尤其是孕妇易造成流产、死胎及死亡。长期以来由于缺乏有效的体外细胞培养系统，影响了对HEV复制机理和致病机制等方面的研究。而随着反向遗传学的发展，利用相关技术将病毒RNA转换为cDNA，从而可以在DNA分子水平上对RNA病毒进行研究。
　　 反向遗传学的核心是构建病毒感染性克隆，因此本试验在已知HEV SAAS-FX17全基因组序列的基础上构建了病毒全基因组cDNA分子克隆并进行动物试验验证其具有感染性。
　　 首先构建HEV全基因组cDNA分子克隆。我们利用基因4型猪HEV SAAS-FX17株全基因组序列中4个单一酶切位点，分别是BamHⅠ、SanDⅠ、HindⅢ、BglⅡ，分5段克隆了HEV的基因组序列。为使克隆的全基因组能插入到合适的载体中，在HEV全基因组的5'端和3'端分别引入SpeⅠ、XbaⅠ酶切位点序列;为使构建的全基因组cDNA可以体外转录，我们在HEV的5'端SpeⅠ酶切序列后加上T7启动子核心序列。将扩增片段连接到p JET1.2 Blunt载体上筛选阳性重组质粒，测序正确的质粒保存备用。为了方便5个HEV片段插入克隆载体，我们利用PCR技术对克隆载体pGEM-9Z进行改造，将其多克隆位点替换为SpeⅠ、BamHⅠ、SanDⅠ、HindⅢ、BglⅡ、XbaⅠ酶切序列，命名为pGEM-9Z-Stuffer。依次将5个HEV片段插入到pGEM-9Z-Stuffer载体中，得到HEV全基因组cDNA克隆pGEM-9Z-HEV。
　　 以线性化的pGEM-9Z-HEV为模板，体外转录合成RNA并多点注射到SD大鼠肝脏内。试验组每只注射200μL RNA，对照组注射等量无菌PBS，观察52天，定期采集样品检测粪便中HEV、血清中HEV抗体的变化。检测粪便中HEV RNA结果显示试验组3#、4#大鼠在感染后第23天首先检测到HEV RNA，在第30天所有大鼠粪便内均能检测到HEV RNA，并可持续至第45天。在第52天仅有1#大鼠粪便中能检测到HEV RNA。通过对遗传标记的检测发现阳性大鼠粪便中检测到的HEV基因组中均存在遗传标志，说明拯救的病毒来自人工构建而非野生毒株的污染。血清中HEV抗体检测结果显示3#、4#和5#大鼠HEV抗体在第31天最先阳转，在第38天抗体浓度达到峰值。而1#、2#最晚，在第38天抗体才开始阳转，在第45天达到峰值。通过对HEV RNA检测和抗体检测结果分析发现感染后的SD大鼠最先在粪便中排毒，此后约1周左右血清中HEV抗体才开始阳转，且抗体阳转的早晚与粪便中排毒的早晚有直接关系，粪便越早排毒，其血清中抗体阳转越早。
　　 综上所述，本试验建立了基因4型猪HEV SAAS-FX17株全基因组cDNA分子克隆，动物试验结果表明其体外转录本具有感染性。

目录

声明

摘要

中英文缩略词表

第一篇 文献综述

第一章 戊型肝炎病毒研究进展

1 病原学

2 流行病学

3 基因型分布

4 病毒基因组结构和蛋白功能

5 复制机理

6 细胞培养

7 动物研究模型

8 HEV感染的诊断

9 HEV研究的意义

参考文献

第二章 RNA病毒反向遗传学研究进展

1 反向遗传学产生的背景

2 反向遗传学原理

3 反向遗传学研究系统建立的前提

4 反向遗传学研究系统构建的策略

5 RNA病毒的拯救

6 拯救病毒的鉴定

参考文献

第二篇 试验研究

第一章 基因4型猪戊型肝炎病毒(HEV)全基因组cDNA克隆的构建

1 试验材料

2 试验方法

3 试验结果

4 讨论

参考文献

第二章 HEV SAAS-FX17株全基因组cDNA克隆人工感染SD大鼠的初步研究

1 试验材料

2 试验方法

3 试验结果

4 讨论

参考文献

全文结论

致谢