鸡胚成纤维细胞感染禽白血病病毒ALV-J后1号染色体微卫星不稳定性研究

摘要

肿瘤病的微卫星不稳定性(MicrosatelliteInstability,MSI)的研究已经有20年的历史，但是除本实验室利用MSI对马立克氏病做过早期诊断，国内外对于鸡肿瘤病的MSI的报道实属罕见。应用微卫星技术研究禽白血病病毒(AvianLeukosisVirus，ALV)感染鸡胚细胞引起宿主基因组变化还没有人报道过。本试验将ALV-J强毒株感染鸡胚成纤维细胞后，应用鸡1号染色体上53个微卫星标记，旨在发现禽白血病病毒感染鸡胚成纤维细胞是否引起细胞基因组微卫星的改变，研究病毒感染早期阶段的基因组变化，为此病的早期诊断及肿瘤的分子发病机制提供线索。
　　 23个SPF鸡胚的组织，每个鸡胚组织的一半提取DNA。另外一半组织培养鸡胚成纤维细胞并接种ALV-J培养7d，ELISA检测培养细胞上清液ALV-Jp27抗原为阳性后，收集细胞并提取DNA。获得含试验和对照的23组样本，用鸡1号染色体上53个微卫星标记为引物进行PCR扩增，扩增产物采用12％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染后用凝胶成像系统记录结果，观察每个微卫星条带的变化。
　　 试验结果统计表显示1号染色体的53个微卫星标记，有32个位点发生不同百分率的MSI，占微卫星标记的60.37％。检测到发生MSI的微卫星位点，表现出不同的百分率，有2个位点MSI变化率较高，ABR0169和ABR0522变化率分别为52.17％和47.83％。高频微卫星不稳定性MSI-H（MSI变化率超过20％）的位点有13个，ABR0007,ABR0169,ABR0204,ABR0280,ABR0287,ABR0319,ABR0329,ABR0379,ABR0522,ADL0268,MCW0036,MCW0058,MCW0145，占1号染色体微卫星标记的24.52％。发生MSI的另外19个位点，ABR0113，ABR0117，ABR0142等，变化率在4.35％-17.39％之间，发生了低频微卫星不稳定性MSI-L。还有21个标记用12％聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法没有检测到变化，这些位点的23个样品中都表现稳定，属于微卫星稳(MSS)。
　　 鸡胚成纤维细胞样本感染禽白血病病毒后有23/23(100.00％)表现出MSI。不同样品1号染色体上MSI统计结果表显示19号样品，MSI发生率最高，为28.30％，其次22号，14号，15号样品MSI发生率分别为26.42％，24.53％，20.75％;MSI变化率均在20％以上。MSI变化率在10％-20％的样品有1号，2号，3号，4号，5号，8号，10号，13号，17号，18号，21号，23号，共12组样品，占总样品数量的52.17％。只有7组样品的MSI变化率在10％以下。
　　 首次发现禽白血病病毒感染鸡胚成纤维细胞1号染色体上发生微卫星不稳定性，且有4个位点与鸡胚成纤维细胞感染马立克氏病毒后均表现微卫星不稳定性，提示这4个位点很可能与肿瘤的发生机制有关。大量的研究发现，肿瘤发生的早期阶段基因组发生广泛的微卫星不稳定性，本研究同样发现微卫星不稳定性，可能为禽白血病的早期阶段研究提供一些基因不稳定方面的参考，有助于此病早期阶段的研究，和为进一步研究禽白血病的致病机理，以及用禽白血病作为模型动物来研究人类淋巴瘤分子免疫治疗的研究提供参考。

目录

论文说明

声明

摘要

文中所引部分缩略语

前言

第一章 禽白血病综述

1 病毒形态学

2 流行病学

3 临床症状

4 禽白血病病毒的复制及培养

5 病毒检测

5．1 基因检测

5．2 病毒血清学检测

参考文献

第二章 微卫星不稳定性在肿瘤分子生物学的研究及应用

1 人医临床中徽卫星不稳定性在肿瘤中的发现

2 禽肿瘤病微卫星不稳定性的研究

3 机理

4 MSI检测方法

参考文献

第三章 鸡胚成纤维细胞的培养及病毒感染

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果

3 讨论

3．1 选用细胞培养获得试验样本

3．2 培养细胞感染ALV-J的阳性判定

4 小结

参考文献

第四章 鸡胚成纤维细胞感染禽白血病病毒后1号染色体微卫星不稳定性的研究

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果与分析

2．1 部分微卫星变性聚丙烯酰酰胺凝胶电泳结果

2．2 不同微卫星位点不稳定性统计结果

2．3 不同样品微卫星不稳定性统计结果

3 讨论

3．1 试验结果的阳性率分析

3．2 微卫星不稳定性在PAGE的表现

3．3 一号染色体MSI特点及其临床病理学意义

3．4 从宿主角度研究禽白血病的致瘤机理

4 小结

参考文献

全文总结

附录 试验配液

致谢