水稻类受体蛋白激酶OsRPK1胞外本体筛选

摘要

类受体蛋白激酶在植物生长发育、组织形成和器官发育、抗逆抗病中都发挥着重要的作用。对类受体蛋白激酶相应配体的研究是揭示其生物学功能和分子作用机制的重要方面。
　　 本文旨在对一个新的水稻类受体蛋白激酶OsRPK1的胞外配体进行初步筛选。为此构建了人工融合蛋白OsRPK1-XA21，以配体与OsRPK1胞外LRR区相互作用诱发XA21胞内激酶区介导的超敏反应作为筛选依据，通过检测细胞的死亡率、活性氧爆发和抗病相关基因表达来判断筛选工作是否成功。
　　 本实验室在前期工作中开展了盐胁迫下水稻质膜蛋白质组学分析，鉴定了一批盐胁迫响应蛋白，其中包括一个分子量98 kDa，等电点5.93的蛋白，将其命名为OsRPK1。后期研究发现，OsRPK1参与生长素的识别和极性运输，并在2，4-D诱导下表达量持续增加。于是我们设想，2，4-D可能作为OsRPK1的胞外配体与OsRPK1相互作用才导致了上述的结果出现。
　　 Xa21是抗水稻白叶枯病致病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae，Xoo)基因家族成员，研究表明，携带有Xa21的水稻品种在受到白叶枯病菌侵害时，可以引发强烈的抗性反应即超敏反应，局部组织坏死阻挡了病原菌的进一步扩散。超敏反应属于细胞程序性死亡，包括一系列的生理生化指标如细胞活力丧失、活性氧爆发、抗性基因启动表达等，这些指标被广泛用作判断植物是否发生超敏反应的标准。本试验将类受体蛋白激酶OsRPK1-LRR+TM与Xa21-JM+KD以及OsRPK1-LRR+TM+JM与Xa21-KD进行融合，利用农杆菌介导的遗传转化体系进行水稻日本晴愈伤组织遗传转化，通过抗性愈伤组织培养带有融合蛋白的水稻悬浮细胞。在抗性悬浮细胞中添加不同浓度的生长素2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-Dichlorophenoxy acetic acid，2，4-D)后，检测悬浮细胞死亡率、悬浮细胞活性氧爆发和植物抗病相关基因OsPR1a的表达状况。
　　 在转基因悬浮细胞中加入0μM、0.1μM、1μM和20μM2，4-D为试验组，以野生型粳稻日本晴悬浮细胞作为阴性对照。测定细胞染料结合率即死亡率、培养基中H2O2含量和OsPR1a基因半定量分析。相比阴性对照而言，AN19和B912的死亡率升高、培养基H2O2在短时间内爆发、抗性基因OsPR1a的表达量半定量也在短时间内出现上调的趋势。上述实验结果说明:2，4-D与OsRPK1胞外LRR区发生了相互作用，2，4-D与OsRPK1胞外LRR区结合后激活了融合蛋白中XA21激酶区的活性，从而引发了XA21触发的超敏反应。通过本研究工作，初步确定了外源生长素2，4-D做为OsRPK1的胞外配体与OsRPK1发生相互作用，建立了OsRPK1配体筛选模型;我们的结果也初步说明，植物类受体蛋白激酶近膜区在信号传导中发挥了重要的信号传递作用，只要近膜区关键氨基酸不发生改变，其来源并不影响信号的传递，LRR区与特异配体结合后发出的信号都可使激酶区激活，开启下游信号通路。
　　 上述结果为进一步全面分析OsRPK1参与生长素信号传导的工作打下了良好基础。

目录

声明

摘要

缩略语词汇表

第一章 文献综述

1．植物类受体蛋白激酶研究进展

1．1．类受体蛋白激酶结构特征、分类及功能

1．2．类受体蛋白激酶关键区域在信号传导中的作用

2．水稻抗白叶枯病菌(Xoo)类受体蛋白激酶XA21

2．1．Xa21发现及克隆

2．2．Xa21编码的蛋白激酶生化特性

3．病原物引起的植物超敏反应(HR)

3．1．HR反应中的细胞死亡是一种程序性细胞死亡(programmed cell death，PCD)

3．2．HR反应特征表现

4．类受体蛋白激酶配体筛选的研究策略

5．本研究目的与意义

第二章 水稻OsRPK1-Xa21融合基因构建

1．材料与方法

1．1．材料

1．2．OsRPK1和XA21生物信息学分析

1．3．OsRPK1-Xa21融合基因构建策略

1．4．水稻根尖总RNA提取

1．5．RNA质量鉴定与完整性电泳检测

1．6．cDNA第一链合成

1．7．各目的片段的PCR扩增

1．8．PCR产物的纯化与回收

1．9．Overlap PCR扩增融合基因

1．10．Overlap PCR产物的纯化与回收

1．11．目的片段与T载体的连接

1．12．超级感受态细胞的制作与重组质粒的转化

1．13．重组质粒的鉴定

2．结果与分析

2．1．OsRPK1和XA21生物信息学分析

2．2．电泳检测RNA质量及纯度鉴定

2．3．各目的片段的PCR扩增结果

2．4．Overlap PCR扩增融合基因

2．5．菌液PCR

2．6．双酶切验证

2．7．DNA序列的测定

3．小结

4．讨论

第三章 带有融合基因的植物表达载体的构建、遗传转化及悬浮细胞的建立

1．材料与方法

1．1．供试材料

1．2．pBI21重组表达载体的构建

1．3．重组表达载体转化农杆菌感受态细胞

1．4．农杆菌EHA105介导的水稻遗传转化

1．5．水稻悬浮细胞的建立

1．6．转基因水稻悬浮细胞的检测

2．结果与分析

2．1．pBI21重组表达载体的构建

2．2．重组表达载体转化农杆菌感受态细胞

2．3．农杆菌EHA105介导的水稻遗传转化

2．4．水稻悬浮细胞的建立

2．5．转基因水稻悬浮细胞的PCR检测

3．小结

4．讨论

4．1．农杆菌介导的遗传转化

4．2．悬浮细胞系的建立

第四章 2，4-D作为类受体蛋白激酶OsRPK1配体的验证

1．材料与方法

1．1．供试材料

1．2．Xoo侵染转Xa21明恢63悬浮细胞引发HR反应

1．3．OsRPK1配体的筛选

2．结果与分析

2．1．转Xa21明恢63悬浮细胞的HR反应测定

2．2．OsRPK1配体的筛选

3．小结

4．讨论

全文结论

1．研究小结

1．1．融合基因OsRPK1-LRR+TM+JM／Xa21-KD和OsRPK1-LRR+TM／Xa21-JM+KD的Overlap PCR扩增

1．2．植物表达载体的构建、遗传转化及悬浮细胞AN19和B912的建立

1．3．2，4-D作为类受体蛋白激酶OsRPK1配体的验证

2．创新之处

3．存在的问题与展望

3．1．试验存在的问题

3．2．展望

参考文献

附录Ⅰ

附录Ⅱ

致谢