水稻类受体蛋白激酶OsRPK1参与生长素信号传导和极性运输的转录组学研究

摘要

植物类受体蛋白激酶广泛参与植物生长发育、激素信号转导、抗病和抗逆等途径，对其开展研究具有重要的理论意义和应用价值。本文利用转录组学研究方法，对水稻中一个新的类受体蛋白激酶OsRPK1在生长素信号传导和极性运输中发挥的作用进行了研究。
　　 本实验室在前期工作中开展了盐胁迫下水稻质膜蛋白组学分析，鉴定了一批盐胁迫响应蛋白，其中包括一个分子量98KD，等电点5.93的蛋白点，在盐胁迫处理后表达水平显著上调。经水稻数据库检索，该蛋白推测为一个类受体蛋白激酶，我们将其命名为OsRPK1.OsRPK1编码区为2910bp，编码969个氨基酸。
　　 为了研究OsRPK1在生长素信号传导中的功能，我们首先利用半定量RT-PCR对水稻OsRPK1进行组织特异性表达分析，结果显示根和叶中OsRPK1表达量最高，茎中OsRPK1的表达量明显低于根和叶。然后分别用植物激素Ethephon(1mM)，2，4-D(100μM),6-BA(100μM),GA3(100μM),ABA(100μM),BR(10μM), MeJA(100μM),SA(1mM)处理水稻3h，12h，48h，取水稻根尖为实验材料，分别检测在不同激素处理下OsRPK1的表达情况，结果显示在48h之内，2，4-D处理后OsRPK1的表达量持续上升;Ethephon、6-BA、ABA、MEJA处理后在3h时OsRPK1的表达量上升，12h后表达量逐渐下降;SA处理后，12h内OsRPK1的表达量上升，48h后表达量开始下降。结果进一步表明OsRPK1主要受生长素诱导表达，OsRPK1作为定位在细胞质膜上的类受体蛋白激酶，可能参与了对外源生长素的信号识别。
　　 为了进一步研究OsRPK1在生长素信号传导和极性运输中可能起到的作用，我们构建了OsRPK1正向表达载体pGSA1285-OsRPK1(+)和OsRPK1反向表达载体pGSA1285-OsRPK1(-)，采用冻融法转入农杆菌EHA105感受态细胞，农杆菌侵染粳稻日本晴胚性愈伤组织，经抗性筛选、分化、炼苗，传代得到转基因T2代植株。半定量RT-PCR检测OsRPK1的表达量，结果显示我们成功获得OsRPK1的过表达植株和抑制表达植株。以上述转基因植株为实验材料，野生型植株为对照，运用荧光定量PCR的方法开展了与生长素信号传导和极性运输相关基因的转录组学分析。首先检测了生长素相关基因转录抑制因子AUX/IAAs家族中IAA1、IAA3、IAA5、IAA6、IAA9及IAA19在转基因及野生型水稻中的表达情况，结果显示这6种基因全部被生长素诱导表达，但6种基因在OsRPK1抑制表达的转基因水稻中受生长素诱导的表达量明显低于在野生型中受诱导的表达量，而在OsRPK1过表达水稻中，IAA1，IAA6，IAA9，IAA19受生长素诱导表达量低于野生型植株，IAA3和IAA5在两个OsRPK1过表达株系中表达量略高于野生型水稻，各有一个株系表达量低于野生型水稻，上述结果表明OsRPK1与AUX/IAAs家族成员的表达密切相关，并因此作为负调控因子参与了生长素信号传导。其次我们比较了野生型水稻和转基因水稻中生长素信号传导相关基因的表达量，发现OsRPK1对多个生长素信号传导相关基因的表达量均有影响;最后我们比较了野生型水稻和转基因水稻中生长素极性运输相关基因LAX家族、AUX1和PIN家族的表达量，结果显示LAX家族、AUX1和PIN家族在OsRPK1抑制表达水稻的表达量高于野生型水稻，在OsRPK1过表达水稻中的表达量低于野生型水稻野生型水稻，提示OsRPK1可能作为负调控因子参与水稻中生长素的极性运输。
　　 综上，本文首次证明了水稻LRR型类受体蛋白激酶OsRPK1参与了生长素的极性运输和信号传导，其中的详细分子机制将成为我们以后研究的主要目标。

目录

声明

摘要

缩略语词汇表

第一章 文献综述

1．植物类受体蛋白激酶

1．1 类受体蛋白激酶

1．2 植物类受体蛋白激酶的生理功能

2．生长素信号转导途径中相关基因

2．1 生长素的分布及在在植物体内的存在状态

2．2 生长素在植物体内的合成与降解

2．3 生长素的运输

2．4 生长素早期响应基因

2．5 生长素信号感知及传递

第二章 OsRPK1基因组织特异性表达及激素处理表达

1 材料与方法

1．1 植物材料

1．2 工具酶和试剂盒

2 半定量检测水稻OsRPK1在水稻不同组织中的表达

2．1 水稻不同组织中RNA的提取

2．2 cDNA第一链合成

2．3 18s rRNA和OsRPK1基因片段的扩增

3．结果与分析

3．1 OsRPK1基因组织特异性表达

3．2 半定量RT-PCR分析OsRPK1基因在不同激素处理下的表达

4．小结

5．讨论

第三章 水稻OsRPK1基因正反义表达载体的构建、遗传转化及验证

1．材料与方法

2．工具酶和试剂盒

3．常用培养基

4．pGSA1285-OsRPK1(+)和pGSA1285-OsRPK1(-)表达载体的构建

4．1 水稻总RNA的提取

4．2 cDNA第一条链的合成

4．3 OsRPK1序列的扩增

4．4 PCR产物的纯化与回收

4．5 目的片段与T载体的连接

4．6 感受态细胞的制作与重组质粒的转化

4．7 重组质粒的鉴定

4．8 表达载体的构建

4．9 农杆菌介导水稻遗传转化

4．10 抗性愈伤组织的诱导分化和生根

4．11 转基因苗的锻炼和移栽

5．结果与分析

5．1 pGSA1285-OsRPK1表达载体的构建

5．2 农杆菌介导的水稻遗传转化

5．3 转基因水稻的检测

5．4 在转录水平上检测转基因水稻中OsRPK1过表达和抑制表达情况

6．小结

7．讨论

第四章 OsRPK1对生长素信号传导与极性运输相关基因表达的影响

1．材料与方法

1．1 实验材料

1．2 工具酶

2．生长素早期响应基因及生长素信号传导与极性运输相关基因的表达

2．1 水稻根尖RNA的提取

2．2 cDNA第一条链的合成

2．3 实时荧光定量PCR在转录水平上检测生长素早期响应基因在野生型及正反义水稻中的表达量

2．4 半定量RT-PCR在转录水平上检测生长素传导相关基因在野生型及正反义水稻中的表达量

2．5 实时荧光定量PCR在转录水平上检测生长素极性运输相关基因在野生型及正反义水稻中的表达量

3 结果与分析

3．1 转录水平上检测AUX／IAAs基因在野生型及正反义水稻中的表达状况

3．2 转录水平上检测外源生长素信号传导相关基因在野生型及正反义水稻中的表达量

3．3 转录水平上检测生长素极性运输相关基因在野生型及正反义水稻中的表达量

4．小结

5．讨论

全文结论

参考文献

附录

致谢