转Bar、Bt基因双抗稻米定性检测及其重组DNA降解的研究

摘要

伴随着环境的恶化及资源的短缺，世界范围内正面临着一场粮食危机，转基因技术也因此在农业生产中得以迅速发展与应用。时至今日，越来越多的转基因作物进入商品化阶段，直接或者间接的进入到人们的食物链中。转基因作物及其制品对人类健康和生态环境的影响越来越引起公众的关注，各国政府纷纷出台了一系列针对转基因生物的法律法规。检测是监管的前提，本实验对转Bar、Bt基因双抗稻米的定性检测方法进行了探索，同时还对转基因双抗稻米内外源基因的在加工过程中的降解规律进行了研究，具体内容如下:
　　 以转Bar、Bt基因双抗稻米为原料，旨在建立一种快速、有效的转基因双抗稻米定性检测方法，为我国转基因稻米的检测、安全评估以及溯源研究提供技术支持。实验针对水稻内源基因SPS和外源重组基因（包括Bar基因、Bt基因、CaMV35S启动子、Ubiquitin启动子和NOS终止子）设计了六对引物，通过退火温度的优化建立起了两套三重PCR检测体系，第一套体系可同时检测SPS基因、Ubquitin启动子、Bt基因，第二套体系可同时检测CaMV35S启动子、NOS终止子、Bar基因。两套体系的反应条件为:预变性94℃5min;变性94℃1min，退火57℃40s，延伸72℃40s，40个循环;72℃延伸7min。结果表明，应用这两套三重PCR检测体系可快速检测出原料中的全部六条目标基因，可用于转Bar、Bt基因双抗稻米及其初级加工品的检测，检测灵敏度可达0.5％。同时，各引物的加入量相同，两套体系的反应条件也相同，不需要使用梯度退火温度，操作简单，对仪器要求也较低，具有经济、高通量的优点。
　　 通过针对SPS基因、CaMV35S启动子、Ubiquitin届动子、NOS终止子、Bar基因和Bt基因进行不同大小片段的PCR扩增以研究双抗稻米内外源基因在加工过程中的降解规律。试验结果表明，不同加工方式对基因的降解作用有所区别:在四天的发酵结束后，酒酿样品中能检测到的SPS基因、CaMV35S启动子、Ubiquitin启动子、NOS终止子、Bar基因和Bt基因的最长片段分别为916bp，446bp，133bp，180bp，370bp以及635bp片段。在酒酿的制作过程中，最稳定的基因是NOS终止子，接下来依次是Bar基因、CaMV35S启动子、Bt基因、SPS基因和Ubiquitin启动子。而在五种不同的热加工方式中，最剧烈的处理方式是油炸，焙烤次之，然后依次是焙烤、发酵、微波和普通蒸煮，而高压蒸煮对文中6个目标基因的降解作用与普通蒸煮相比几乎没有差别。最稳定的基因是CaMV35S启动子，NOS终止子次之，之后依次是Bar基因、Ubiquitin启动子、Bt基因和SPS基因。实验中设计的长度低于200bp的靶序列拥有较好的稳定性（NOS除外）。

目录

声明

摘要

缩略词中英文对照表

1 引言

1．1 转基因育种技术的意义

1．2 转基因作物常见性状

1．2．1 抗虫性状

1．2．2 抗除草剂性状

1．2．3 抗病性状

1．2．4 抗逆性状

1．2．5 其他性状

1．3 转基因作物种植情况

1．4 转基因水稻育种相关研究

1．4．1 单价转基因水稻

1．4．2 双价转基因水稻

1．5 转基因水稻安全性及其管理

1．5．1 转基因水稻安全性的研究

1．5．2 转基因标识管理

1．6 转基因检测技术的研究进展

1．6．1 蛋白质水平上的检测技术

1．6．2 核酸水平上的检测技术

1．7 本研究的目的和意义

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．11 原料

2．12 主要试剂

2．2 仪器设备

2．3 实验方法

2．3．1 建立多重PCR检测体系

2．3．2 双抗稻米DNA降解规律研究

3 结果与分析

3．1 多重PCR检测

3．1．1 单个目标基因PCR扩增结果

3．1．2 三重PCR退火温度摸索

3．1．3 优化后三重PCR特异性扩增结果

3．1．4 多重PCR检测灵敏度的确定

3．1．5 三重检测体系在加工品中的验证

3．2 不同加工条件对内外源DNA降解的影响

3．2．1 转基因双抗大米加工品的制作

3．2．2 酒酿及米果中SPS基因的PCR检测结果

3．2．3 甜米酒及米果中CaMV35S启动子的PCR检测结果

3．2．4 甜米酒及米果中Ubiquitin启动子的PCR检测结果

3．2．5 酒酿及米果中NOS终止子的PCR检测结果

3．2．6 酒酿及米果中Bar基因的PCR检测结果

3．2．7 酒酿及米果中Bar基因的PCR检测结果

4 讨论

4．1 多重PCR检测体系

4．2 转基因双抗水稻内外源降解研究

5 结论

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间论文发表情况