青虾咽侧体抑制激素(Allatostatin,AST)基因全长cDNA序列的克隆及表达分析

摘要

青虾，学名日本沼虾(Macrobrachium nipponense)，属节肢动物门(Arthropoda)，甲壳纲(Crustacea)，十足目(Decapoda)，长臂虾科(Palaemonidae)、沼虾属(Macrobrachium)，广泛分布于全国各地。具有病害少、生长快、营养丰富等优点，是我国淡水虾蟹类的重要养殖品种。近年来随着青虾累代养殖规模逐渐扩大，出现了种质退化，规格小、性早熟等现象，严重影响了青虾的养殖效益。因此，开展青虾蜕皮及生殖发育相关功能和机制的研究十分迫切。节肢动物门的昆虫和甲壳动物都具有周期性蜕皮等相似的生理特性。首先在昆虫中发现的咽侧体抑制激素具有调节蜕皮和生殖的重要功能。甲壳动物脑神经细胞分泌的甲壳动物咽侧体抑制激素(Allatostatin，AST)神经肽也具有促进蜕皮、性腺成熟、卵成熟以及调控生殖等重要功能。因此本文以青虾脑组织为材料，对咽侧体抑制激素(AST)基因全长cDNA序列进行了克隆，并检测了AST基因在成体青虾不同组织中的表达，以期为青虾AST基因相关功能的研究奠定基础，同时也为青虾蜕皮机制及生殖发育的研究提供参考。
　　 本研究在传统基因克隆方法的基础上采用分段克隆的方法克隆了青虾AST基因的全长cDNA序列，即把青虾AST基因全长cDNA序列分成几个片段分别扩增。本实验共扩增了4段中间片段cDNA，经比对拼接后得到AST基因cDNA的全部中间序列，再与cDNA3'末端及5'末端拼接得出AST基因的全长cDNA序列。青虾AST基因cDNA序列全长2995bp，包括242bp的5'非编码区(UTR)，647bp的3'UTR，2106bp的开放阅读框(ORF)。在poly(A)上游具有明显的加尾信号AATAAA，开放阅读框共编码701个氨基酸多肽前体，预测蛋白质分子量为78.7kDa，理论等电点为9.15。氨基酸多肽前体包括27个氨基酸组成的信号肽和674个氨基酸组成的成熟肽。成熟肽可加工成35个AST多肽，这些多肽在C末端都具有相同的Y/FXFGL-amide结构，属于典型的A型-AST，与昆虫纲蜚蠊目昆虫的AST多肽结构特征相同。将青虾的AST多肽与克氏螯虾(Procambarus clarkii)、三叶真蟹(Carcinus maenas)、斑节对虾(Penaeus monodon)、大海虾(Panulirus interruptus)、罗氏沼虾(Macrobrachiumrosenbergii)的AST多肽比对，结果显示保守氨基酸为Tyr、Phe、Gly、Leu几种，保守的多肽为AST-19，26，29，青虾特有的多肽为AST-3，8，16，20，24。部分昆虫和甲壳动物AST蛋白相似度比对显示，相似度均在60％以上，表明AST在无脊椎动物的进化中是相对保守的。系统进化树分析表明，甲壳动物和昆虫各自聚为一支，与传统分类学分类结果相吻合，其中青虾与罗氏沼虾最先聚在一起，亲缘关系最近。
　　 采用荧光定量PCR(qRT-PCR)技术分析了AST基因在青虾脑、肠道、肝脏、心脏、精巢、卵巢6种组织中的表达情况。以β-actin基因为内参基因。结果显示，AST mRNA在6种组织中均有表达，表达水平依次为:肝脏＞肠道＞精巢＞脑＞心脏＞卵巢。已有的研究结果表明，AST多肽除了具有影响甲壳动物蜕皮和生殖的作用外，还能影响肠道和心脏的收缩频率和幅度。本研究中，AST在肝脏中检出量最高，与其他组织表达量均达到极显著差异，其次在肠道和精巢中也具有较高的表达量，在脑和心脏中的表达量相对较低，在卵巢的表达量最低，组织间差异不显著。
　　 本研究首次克隆得到了青虾AST基因的全长cDNA序列，对其结构特征进行了分析，并首次采用荧光定量PCR技术检测了该基因在青虾成体不同组织间的表达差异。研究结果为青虾AST基因功能的研究奠定了基础，并可为青虾蜕皮及生殖发育机制的研究提供参考，同时为甲壳动物相关研究提供借鉴。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

第一节 咽侧体抑制激素的研究进展

1 神经肽类激素研究进展

2 咽侧体抑制激素(AST)的结构

3 咽侧体抑制激素(AST)的功能

4 咽侧体抑制激素(AST)的应用

第二节 基因克隆、表达研究方法的概述

1 基因克隆研究方法的概述

2 基因表达研究方法的概述

第三节 本研究的目的与意义

第二章 青虾咽侧体抑制激素基因的克隆和序列分析

1 材料

1．1 实验虾

1．2 试剂

1．3 仪器

2 方法

2．1 青虾脑组织总RNA的提取

2．2 RNA的浓度测定和质量检测

2．3 cDNA第一链的合成

2．4 PCR引物设计

2．5 中间片段的扩增

2．6 青虾AST基因的3’ RACE

2．7 青虾AST基因的5’ RACE

2．8 PCR产物的克隆

2．9 序列的测定及分析

3 结果与分析

3．1 青虾脑组织总RNA抽提结果

3．2 青虾AST基因中间片段的分离

3．3 青虾AST基因3’端的分离

3．4 青虾AST基因5’端的分离

3．5 序列分析

3．6 青虾AST氨基酸序列比对

3．7 青虾AST蛋白相似度、氨基酸种类分析

3．8 系统进化分析

4 讨论

第三章 青虾咽侧体抑制激素基因在不同组织中的表达分析

1 材料

2 方法

2．1 实验原理

2．2 总RNA的提取

2．3 cDNA第一链的合成

2．4 PCR引物设计

2．5 半定量PCR(RT-PCR)

2．6 荧光定量PCR反应

2．7 结果判断

3 结果

3．1 青虾各组织总RNA的提取

3．2 荧光定量PCR引物检测

3．3 青虾AST mRNA在不同组织中表达的RT-PCR分析

3．4 青虾AST mRNA在不同组织中表达的qRT-PCR分析

3．5 AST mRNA相对定量结果

4 讨论

全文结论

参考文献

附录 实验试剂及配置

致谢

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